发酵豆粕生产大豆多肽研究_余勃

发酵豆粕生产大豆多肽研究

余　勃，陆兆新＊

（南京农业大学食品科技学院，江苏　南京 ２１００９５）

摘 要：　利用３０Ｌ发酵罐发酵豆粕，对微生物法生产大豆多肽的工艺进行了研究。结果显示，随着发酵时间的延长，发酵液水解度不断上升，并在发酵后期达到３０％左右；发酵液中的多肽含量先增后减，表明发酵进程是按大豆蛋白水解成多肽，多肽水解成游离氨基酸顺序进行。酶活分析表明发酵菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＳＨＺ３能同时分泌蛋白酶和羧肽酶，分别水解大豆蛋白和肽链末端的疏水性氨基酸，使大豆蛋白的水解和多肽的脱苦在发酵过程中一步完成，生产出不苦的大豆多肽。凝胶层析表明，随着发酵时间的延长，发酵液中肽链变短，２４ｈ发酵所得主要为３００～１０００Ｄａ具有潜在生物活性的短链肽。关键词：大豆多肽；发酵；豆粕；Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＳＨＺ３

　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ Ｓｏｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｂｙ　Ｄｅｆａｔｔｅｄ　Ｓｏｙ　Ｍｅａｌ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ＹＵ　Ｂｏ，ＬＵ　Ｚｈａｏ－ｘｉｎ＊

（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｙ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｂｙ　ｓｏｙ　ｍｅａｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｗｉｔｈ　３０Ｌ　ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ．　Ｔｈｅ　ｄｅｇｒｅｅｏｆ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　（ＤＨ）　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ　ａｎｄ　ｒｅａｃｈｅｄ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　３０％　ａｔ　ｔｈｅ　ｌａｔｅｒ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｌｉｑｕｉｄ　ｆｉｒｓｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，　ｓｏ　ａｓ　ｔｏ ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｏｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｔｏ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｉｎｔｏ　ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＳＨＺ３　ｃａｎ　ｓｅｃｒｅｔｅｂｏｔｈ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｎｄ　ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ，　ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ　ｓｏｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｃｕｔ　ｄｏｗｎ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅｔｅｒｍｉｎｕｓ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，　ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｎ－ｂｉｔｔｅｒｎｅｓｓ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｇｅｌ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ－ｐｈｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ　ｌｉｑｕｉｄ　ｏｆ　２４ｈ　ｃａｎ　ｍａｉｎｌｙ　ｂｅ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ｃｈａｉｎ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｗｉｔｈ　３００～１０００Ｄａ．Ｔｈｉｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｓｉｚｅ　ｉｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ｏｆ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｏｙ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｄｅｆａｔｔｅｄ　ｓｏｙ　ｍｅａｌ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＳＨＺ３

中图分类号：ＴＳ２０１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０２－０１８９－０４

收稿日期：２００６－０１－０５ ＊通讯作者

基金项目：江苏省“十五”科技攻关项目（ＢＥ２００１４０６）

作者简介：余勃（１９７８－），男，博士研究生，研究方向为食品微生物与生物技术。

一直以来对食物蛋白进行水解改性都是人们研究的

热点，因为蛋白水解成多肽后，具有其母体蛋白所没有的生物活性和良好的加工特性［１］。其中大豆多肽是各种生物活性肽的重要来源，而利用酶对大豆蛋白进行水解也被认为是最有效的大豆多肽制备工艺［２］。从作用的方式上来分，蛋白质的酶水解可分为直接酶解和间接酶解。目前国内外对多肽的制备研究主要集中在利用纯酶制剂进行直接酶解，由于商品酶制剂成本高昂，直接酶解法生产大豆多肽代价巨大，限制了其在发展中国家的工业化生产。因此，基于间接酶解法的微生物发酵制备多肽的工艺，已日益受到研究人员的关注［３］。

我国近年来在此领域开展了较多研究，万琦等［４－５］筛选到一株能在发酵过程中产蛋白酶和外肽酶的枯草芽孢

杆菌，利用此菌所产蛋白酶的作用将大豆蛋白水解成短

肽，利用此菌所产羧肽酶的作用将短肽末端的疏水性氨基酸切除，从而实现了酶解和脱苦一步完成的大豆多肽发酵生产。邵伟等［６］也将一株经驯化处理的枯草芽孢杆菌用于发酵制备大豆多肽；李里［７］和潘进权［８］等则研究了利用一株真菌为发酵菌株，通过液体发酵法来制备大豆多肽的工艺。在工业化生产方面，张雁平［９］通过成本核算，认为采用发酵法生产大豆蛋白活性肽产品与酶解法相比，得率提高１０％～２０％，成本仅为酶解法的５０％～６０％。因此，该技术有良好的应用前景和经济性。

本研究在前人工作基础上，利用本实验室筛选保藏的枯草芽孢杆菌为发酵菌株，以制油工业的副产品－豆粕为底物，对发酵法生产大豆多肽的工艺进行了研究，

图２ 不同时间发酵液的多肽浓度和游离氨基酸含量

Fig.2 The content of peptide and free amino acid in fermented

liquid with different fermentation time

１０９８７６５４３２１００

８

１６２４３２４０４８多肽浓度（ｍｇ／ｍｌ）

发酵时间（ｈ）

１００９０８０７０６０５０４０３０２０

１００

氨基酸浓度（μｍｏｌ／ｍｌ）

多肽浓度（ｍｇ／ｍｌ）

氨基酸含量（μｍｏｌ／ｍｌ）

并着重阐明发酵过程中的大豆蛋白水解和脱苦机制，为大豆活性肽的工业化低成本生产提供参考。１材料与方法１．１

材料

菌种Ｂａｃｉｌｌｕｓ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＳＨＺ３由本实验室筛选保藏［４］；

豆粕（蛋白含量４３．７％） 南京北星牧业有限公司；苯甲氧羰－Ｌ－谷酰－Ｌ－酪氨酸（Ｚ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ）、葡聚糖凝胶（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５）、蓝色葡聚糖２０００ Ｓｉｇｍａ公司；Ｆｏｌｉｎ－酚试剂 北京赛吉；其它试剂均为分析纯。１．２

仪器

ＦＪＧ－０．０３型发酵罐 镇江格瑞生物工程有限公司；５８０４Ｒ型冷冻离心机 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ德国公司；ＵＶ－２４５０型可见紫外检测仪 Ｓｈｉｍａｄｚｕ日本公司；层析系统 上海沪西分析仪器厂。１．３方法

１．３．１

发酵菌株种子液的制备

从活化后的菌种保藏斜面中以无菌操作挑取两环接

种于种子培养基中，３７℃，１２０ｒ／ｍｉｎ，培养２４～３６ｈ，

使菌体浓度达到１０８ＣＦＵ／ｍｌ。（种子培养基：牛肉膏０．３％，胰蛋白胨１％，ＮａＣｌ　０．５％，ｐＨ７．２）１．３．２

豆粕发酵罐发酵

按５％接种量将发酵菌株种子液火焰环接种于发酵

液中，３７℃，搅拌通气培养，每隔８ｈ　取样。（发酵培养基：豆粕　５％，葡萄糖　０．５％，自然ｐＨ）

１．３．３大豆多肽液的分离

将发酵液于４℃，１００００ｒ／ｍｉｎ，冷冻离心。取上清夜微孔滤膜过滤（０．４５μｍ），滤液即为大豆多肽液混合液。１．３．４

大豆多肽分子量分布的测定

调整大豆多肽液蛋白浓度为５％（Ｗ／Ｖ），以２ｍｌ上样体积进行凝胶层析。柱条件：Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５　（２．６×１００ｃｍ），流速３０ｍｌ／ｈ，每管收集５ｍｌ，检测波长２２０ｎｍ，洗脱液为去离子水，分子量标品为蓝色葡聚糖２０００

（ＭＷ２０００ｋＤａ）、胰蛋白酶（２３３ｋＤａ）、钴胺酰胺（ＶＢ１２，１３５５Ｄａ）、还原谷胱甘肽（ＧＳＨ）（３０７Ｄａ）、甘氨酸（７５Ｄａ）。１．３．５水解度的测定

按照文献［１０］所述方法进行测定。１．３．６游离氨基酸含量的测定

按照文献［１１］所述方法进行茚三酮显色测定。１．３．７

多肽含量的测定

多肽含量以酸可溶性多肽计，将等体积的三氯乙酸（ＴＣＡ，０．４ｍｏｌ／Ｌ）　加入到大豆多肽混合液中，静置０．５ｈ后以１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去除酸不溶性的蛋白和长链肽沉淀。用双缩脲法测定上清夜中的多肽含量［１２］。

１．３．８

发酵液中蛋白酶活的测定

以酪蛋白（２％）为底物，按文献［１３］采用Ｆｏｌｉｎ－酚法测定，一个蛋白酶活力单位（Ｕ）定义为每小时释放出１μｇ酪氨酸所需的酶量。１．３．９

发酵液中羧肽酶活的测定以Ｚ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）为底物，按文献［１４］采用茚三

酮显色法测定，一个羧肽酶活力单位（Ｕ）定义为每小时释放出１μｇ酪氨酸所需的酶量。

１．３．１０多肽液苦味值的评定

按照文献［４］所述方法进行感官品质评定。２结果与分析

２．１

豆粕发酵动态的研究

为考察发酵效率，对不同时间发酵液的水解度进行

测定，结果如图１所示。在发酵前期（０～３２ｈ），水解度随着发酵时间的延长显著上升，并在３２ｈ达到３０％左右。而发酵后期水解度的增幅明显趋缓，这一方面是由于在发酵后期菌体进入衰亡期，所分泌的水解酶量急剧下降，另一方面发酵体系的理化条件（如ｐＨ，底物浓度）发生了不利于水解酶活力的变化，从而使发酵后期的蛋白水解效率降低。

图１ 不同时间发酵液的水解度

Fig.1 Degree of hydrolysis (DH) of fermented liquid in

different

time

４０３５３０２５２０１５１０５００

８

１６

２４

３２

４０

４８

水解度（％）

发酵时间（ｈ）

图２　显示了发酵过程中发酵液的多肽浓度和游离氨

基酸含量的变化。其中多肽浓度呈现先增后减趋势，在２４ｈ达到最高值８．２ｍｇ／ｍｌ；而游离氨基酸含量一直维持

增长并在最后８ｈ急剧上升，这表明在发酵过程中，豆粕中的大豆蛋白首先被发酵菌株分泌的肽链内切的蛋白酶类水解成不同链长的多肽，多肽浓度累积增加；而后大豆多肽在外肽酶的作用下被进一步水解成游离氨基酸，发酵液中多肽浓度降低而氨基酸浓度显著增加。２．２

发酵菌株产酶动态的研究

液中的多肽分子量分布主要在几百到几千之间，随着发酵的进行（２４ｈ），大分子的长链肽逐步被酶解，含量降

低，发酵液中主要为短链肽（Ｍｗ３００～１０００Ｄａ），对应的肽链平均长度为３～５，而游离氨基酸的含量也大大升高。因此，在发酵中期即可得到高含量的短链肽。而在发酵初期（８ｈ），发酵液中主要为大分子量的大豆蛋白和长链肽，而在发酵后期（４８ｈ）主要为游离氨基酸，多肽含量很低（凝胶层析数据未列）。众多研究表明，只有短链的大豆多肽（３～１０个氨基酸残基）才具有特定的生物活性［１６－１７］，因此，本工艺的发酵时间定为２４ｈ最佳。３

结 论

和直接以发酵菌株的次生代谢产物为产品的生物活性肽的生产不同，本研究利用微生物发酵来产大豆多肽主要利用的是发酵菌株的产酶及酶解能力。豆粕是制油工业的副产品，富含大豆蛋白，不仅价格低廉（约为大豆分离蛋白的十分之一），而且能提供了菌体生长所需的碳氮源和无机盐，十分适于作为发酵底物。由本实验室所筛选保藏Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＳＨＺ３，能在以豆粕为主的液体培养基上良好生长，并在生长代谢过程中大量分泌胞外蛋白酶和羧肽酶，在发酵过程中将原料中的大豆蛋白水解并脱除苦味根源的肽链末端疏水性氨基酸。因此，控制好发酵的进程，便可得到具有特定链长和对应功能的无苦味大豆多肽。

本发酵工艺不仅与纯酶水解法制备大豆多肽的工艺相比优势明显，而且与目前同类的发酵法制备多肽工艺相比，成本更为低廉（利用豆粕而不是大豆分离蛋白作底物）；发酵效率高（２４ｈ水解度达２７％）；多肽品质好（主要为３００～１０００Ｄａ短肽链），更为重要的是解决了蛋白水解产物苦味难除的问题［１８］，因此是一项极具潜力的多肽制备工艺。进一步的工作有待于在对发酵液中多肽混合物进行分级分离，纯化精制等下游技术上展开。

图３ 不同时间发酵液的蛋白酶和羧肽酶活力

Fig.3 Enzyme activity curve of protease and carboxypeptidase

in fermented liquid ９００８００７００６００５００４００３００２００１０００

０

８

１６

２４

３２

４０

４８

蛋白酶活（Ｕ／ｍｌ）

发酵时间（ｈ）

３００２５０２００１５０１００５００

羧肽酶活（μｍｏｌ／ｍｌ）

蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）羧肽酶活力（Ｕ／ｍｌ）

为进一步了解Ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＳＨＺ３发酵豆粕产大豆多肽的具体水解机制，对菌株的产酶动态进行了研究（图３），并对不同时间发酵液的苦味值进行感官评定（表１）。从中可以看出在发酵液的蛋白酶，羧肽酶活力和发酵液的苦味值之间存在一定的联系。在０～８ｈ，菌体主要分泌蛋白酶，将大豆蛋白初步水解成长链肽，发酵液略有苦味；随着发酵的继续进行（８～１６ｈ），蛋白酶将长链肽进一步水解成段中短链肽，同时在外肽酶的作用下，肽链内部的疏水性氨基酸大量暴露，使得发酵液苦味激增；发酵中后期（２４～３２ｈ），菌体开始大量分泌羧肽酶，其能从肽链的羧基末端将疏水性的氨基酸切除从而脱苦［１５］；至发酵后期（４０～４８ｈ），发酵液中主要为非苦味的短链肽和游离氨基酸。２．３

不同时间发酵液中多肽的分子量分布

为了对发酵过程中发酵液多肽分子量的大小变化进行跟踪，利用凝胶层析对不同时间发酵液中的多肽分子量分布进行研究。从图４可以看出，在１６ｈ时，发酵

不同发酵时间的

不同水解度的大豆样品蒸馏水

多肽液ａ

（ｈ）

蛋白酶解液ｂ（％）８

１６２４３２４０４８１８２５苦味值

０

１

３

１

０

０

０

４

５

表１ 不同样品的苦味评定值

Table 1 Bitterness score of different sample

注：ａ．不同时间的发酵液样品均将其浓度调整为相当于蛋白浓度１００ｍｇ／ｍｌ

（紫外吸收，ＯＤ２８０ｎｍ）后评定；ｂ．大豆蛋白酶解液由木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制得。

４３．５３２．５２１．５１０．５０８５１６５

２１５２６５３１５３６５４１５

Ａ２２０ｎｍ

洗脱体积（ｍｌ）

ＡＢ

Ｄ

Ｃ

↓↓↓

↓

Ａ．胰蛋白酶（２３３ｋＤａ）；Ｂ．钴胺酰胺（１３５５Ｄａ）；Ｃ．谷胱甘肽　（３０７Ｄａ）；Ｄ．甘氨酸（７５Ｄａ）。

图４ 不同时间发酵液中多肽的分子量分布

Fig.4 The molecular size distribution of peptide in fermented

liquid of 16h and 24h

１６ｈ发酵液２４ｈ发酵液

参考文献：

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［１６］ＧＩＢＢＳ　Ｂ　Ｆ，　ＺＯＵＧＭＡＮ　Ａ，　ＭＡＳＳＥ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃ－ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏａｃｔｉｖｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｙ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ａｎｄ　ｓｏｙ－ｆｅｒｍｅｎｔｅｄｆｏｏｄ［Ｊ］．　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　２００４，　３７：　１２３－１３１．

［１７］ＬＥＥ　Ｋ　Ａ，　ＫＩＭ　Ｓ　Ｈ．　ＳＳＧＥ　ａｎｄ　Ｄｅｅ，　ｎｅｗ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ｔｈａｔ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ［Ｊ］．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，　９０：　３８９－３９３．

［１８］刘通讯，　林勉，　杨兰．　鸡酶解液中苦味肽的提取及微生物法脱苦的研究［Ｊ］．　食品科学，　１９９０（１０）：　１０－１２．

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