外显子

individuals that are exome sequenced variants from affected individuals variants from unaffected
常染色体隐性遗传病：
单基因疾病
样本 平台
• 一个先天性黑蒙症的 庞大家系
• the SureSelect 50 Mb All Exon Targeted Enrichment kit • Illumina HiSeq 2000
Adapt from： Ignacio Varela, et al. Exome sequencing identifies frequent mutation of the SWI/SNF complex gene PBRM1in renal carcinoma. Nature (2011)
肝癌研究：
1
Adapt from： Yi
Shi. et al. Exome Sequencing Identifies ZNF644 Mutations in High Myopia. PLoS Genetics 7(6), 1–10 (2011)
来自近亲家庭的罕见隐性遗传病：
单基因疾病
样本
平台 方法 结论
样本 实验 平台 方 法
• 十个肝癌患者的肝癌原发灶和侵犯肝脏 门静脉的转移灶（PVTT）
复杂疾病
• NimbleGen Human Exome 2.1M Arrays & Illumina/Solexa sequencing • SureSelect Human All Exon Kit (38 Mb) & ABI SOLiD sequencing
• 测10个患者肝癌原发灶和配对的PVTT的 外显子 • 扩大试验，测了110个患者在10个基因上 的突变情况
结 论
• 发现肿瘤细胞存在347个基因突变，验证 知344个准确 • 发现其中十个突变基因与肝癌转移相关
Adapt from： Jian Huang, et al. Exome sequencing of hepatitis B virus– associated hepatocellular carcinoma. Nature Genetics (2012)
应用--复杂疾病
复杂疾病：也被称为多基因遗传病，是指由多个
微效基因的累加效应结合环境因素共同作用所导致 的疾病。
癌症 • 具有异质性 其他复杂疾病 • 糖尿病 • 精神分裂症
取样策略
复杂疾病
建议选择尽可能多的患者病变组织样本，且要有每个
患者的正常组织或外周血样作对照（control）。
生物信息分析策略
经过GATK软件进行局部重新比对和质量校正。
3. 变异位点统计：利用GATK软件发现SNP位点、 Small InDels并进行 统计。
4. 注释：利用Annovar软件对SNP和Small InDels进行注释。
应用——单基因疾病
单基因疾病（孟德尔疾病）：由一对等位基因控制
的疾病或病理性状，有显性、隐性两种遗传方式。
方法
结论
• 先测2个患者和3个正常人的外 显子，经过突变筛选后在284个 非关联患者上sanger测序验证。
• 发现在此家系中新的导致先天 性黑蒙症的突变
Adapt from： Marni J Falk, et al. NMNAT1 mutations cause Leber congenital amaurosis. Nature Genetics (2012)
外显子 组测序
高通量 测序
目标序列捕获：
PCR
简介
通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定差
玻璃片基
芯片杂交
液相捕获 杂交效率更高 便于自动化操作
外显子组测序的实验流程
基因组DNA提取 D杂交捕获
上机测序
Population stratification
肾癌研究：
Samples Collection Genomic library preparation Exon enrichment seven cases of ccRCC 76 base pair paired-end reads on the Illumina GAIIx platform
• 一个近亲家庭
• SureSelect human exome kit • SOLiD 4 system sequencing slide
• 测1个患者的外显子，经过突变筛 选根据遗传类型确定致病突变。
• 发现成骨不全症的致病突变 SERPINF1。
26,922 variations
Adapt from： Jutta
单基因疾病
清楚相关研究背景的隐性遗传病：
Whole-exome sequencing
A patient
Identify unreported variants
Prioritize genes Candidate based strategy NMNAT1
Adapt from： Pei-Wen Chiang, et al. Exome sequencing identifies NMNAT1 mutations as a cause of Leber congenital amaurosis. Nature Genetics (2012)
复杂疾病
Agilent SureSelect Human Exon Kit Substitution variant calling
variant calling
PBRM1 mutation screening Insertion/Deletion variant calling a further 257 RCC cases
Discovery of novel variants Assessment of rare coding variation in empirical data
复杂疾病
quality control filtering
Association analysis
Power calculations
Replication to confirm association
单基因疾病
常染色体显性遗传病：
样本 平台
• 一个高度近视家系
• NimbleGen 2.1M HD array • Illumina Genome Analyzer II platform • 先测2个患者的外显子，经 过突变筛选后在600个非关 联患者上sanger测序验证。
方法
结论
• 发现在此家系中导致高度近 视的是ZNF644突变
13,491
6,299
318
17
3
Becker. et al. Exome Sequencing Identifies Truncating Mutations in Human SERPINF1 in Autosomal-Recessive Osteogenesis Imperfecta. The American Journal of Human Genetics 88, 362–371(2011)
外显子组测序 在疾病研究中的应用
目 录
简介
• 外显子组测序 • 目标序列捕获
• 实验流程 • 外显子捕获流程 技术流程 • 生物信息学分析流程
应用
• 单基因疾病研究 • 复杂疾病研究
简介
外显子组测序：
是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉 并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
序列捕 获技术
生物信息学分析
外显子捕获流程
技术流程
生物信息学分析流程
技术流程
图注
生物信息学分析内容
技术流程
1. 对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量 reads 的处理。
2. 测序评估：数据产出统计 、测序饱和度分析、评估后得到的有效序
列利用BWA软件进行序列比对，mapping回参考基因组序列，并利用 Picard软件去除PCR过程中产生的duplications，得到有效比对序列，再
显性遗传
隐性遗传
单基因疾病
取样策略
建议选择同一家系中至少两个患者和一至多个正常人 进行外显子测序。
如果能找到独特的家系，可根据情况减少样本量。 近亲家庭 十分罕见的隐性基因遗传病 知道疾病相关研究背景（基因功能等）
突变筛选策略
单基因疾病
Affected individuals
Presumably healthy individuals carrier