三种酶活性测定

水体中碱性磷酸酶活性：对硝基苯磷酸二钠(p—NpP，sigma公司)，本实验中所选择的反应条件为：pH8.4(用Tris缓冲溶液调)、温度30℃、反应物体积5mL、反应时间6h、波长4l0nm，岛津uv-2401分光光度计测定．

总的

0.45um 膜藻类

0.2um 细菌

溶解性的物质

6.Berman T Alkaline phosphatases and phosphorus availability

in Lake Kinneret 1970

7..洪华生海水中碱性磷酸酶活力的测定及其在磷循环中的作用

初探1992(04)

8.12.Chrost R J.Overback J. Kinetics of alkaline phosphatase

acitivity and phosphorus availability for phytoplankton and bacterioplankton in lake Plu βsee (North German Eutrophic

lake) 1987(13)

底泥中碱性磷酸酶(APA)测定方法

AP(磷酸酶) 催化无色底物0.1 % p-对硝基苯磷酸二钠(p-NPP) 产生稳定的黄色产物P-NP, 在410 nm可见光下,通过测定P-NP的产生速率,即可换算出AP 活性APA.

1. 试剂

1. NaOH: 4g NaOH溶于100mL H2O中

对硝基苯磷酸二钠(p-NPP) : 6.75g p-NPP 溶于水中, 并稀释至1000ml.(1ml含25mg酚)

2. 底物混合液：1ml p-NPP百倍母液+99ml tris-HCl

3. Tris-HCl缓冲溶液: 1g Tris中加入2.061ml 浓HCl,用水定容至1000mL,溶液的pH为8.5

4. 对硝基苯酚储备液(1g/L): 1g对硝基苯酚溶于蒸馏水中并稀释至1000ml,溶液保存在暗色瓶中.

2. 标线制备(辛承友2004)

A. 对硝基苯酚使用液(10mg/L即1ml含10ug酚): 10ml对硝基苯酚储备液用缓冲液稀释定容到1000ml容量瓶中

B. 分别取0,1,2,3,4,5ml 对硝基苯酚使用液于10ml EP管内，分别加缓冲液

5,4,3,2,1,0ml(对硝基苯酚浓度分别为0,2,4,6,8,10mg/L)

C. 加入0.5ml NaOH

D. 离心5000转,10min

E. 离心后取上清, 以水为参比,410nm比色

3. 实验组

A. 向EP管内加入0.1g sediment (2ml water)

B. 加底物混合液5ml

C. 30o C 6h(摇床上振荡恒温培养)

D. 加NaOH 0.5ml, 离心5000转,10min

E. 以水为参比,410nm测吸光度

4. 对照组

A. 向EP管内加入0.1g sediment

B. 加NaOH 0.5ml，加底物混合液5ml

C. 30o C 6h(摇床上振荡恒温培养)

D. 离心5000转，10min

E. 以水为参比,410nm测吸光度

对照组和实验组同时进行,标线制备一次即可

底泥或水样零下20度保存

底泥中脱氢酶(DHA)测定

采用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)为基质经脱氢酶催化还原反应后生成红色产物(TTCH2-trifenylformazane，T p F)，丙酮萃取。采用分光光度计于485nm波长处测定其吸光值，根据标线计算出T p F生成量来表示DHA。

依次加人Tris-HCl缓冲溶液1.5 mL、0.l mol/L葡萄糖溶液、0.4 % TTC溶液和0.36 % Na2SO3溶液各0.5 mL，置于37 ℃恒温水浴振荡仪中培养2 h后取出，加人0.5 mL甲醛终止反应，准确加人5 mL丙酮，37 ℃振荡萃取10 min，在3000 r/min的条件下离心5 min，492 nm处测定吸光度。在上述条件下，l h产生1 μg TF的量为一个酶活力单位。

底泥预处理：取底泥0.2g sediment于EP管中，用蒸馏水振荡混合后，5000 r/min离心5 min，弃去上清液，如上方法洗涤三次

1.试剂

1.0.36%硫酸钠溶液: 0.36g硫酸钠用水定容至1000ml

2.TF储备液：称取30mgTF用定溶于50mL棕色容量瓶中，此溶液即为l g/L TF 的标准溶液

2. Tris-HCl缓冲液(pH＝8.4)：称取6.037g Tris，加入20mL 1mol/L HCl, 再定容至1000mL

3. 甲醛

4. 丙酮

5. 0.4%TTC溶液: 取0.4gTTC溶于Tris-HCl缓冲液定容至1000mL,贮存于棕色瓶

6. 底物混合液TTC: Tris-HCL=1:3

2.标线制备(周春生1996)

A. TF储备液：称取50mgTF定溶于50mL茶色容量瓶中，此溶液即为l g/L TF 的标准溶液.

B. TF梯度溶液：分别吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7mlTF标准储备液，定容至5ml，即配成浓度分别为0、20、40、60、80、100、120、140 g/mL TF系列溶液.

C.绘制TF浓度对应吸光值的曲线.

3. 实验组

A. 0.2g sediment +4ml底物混合液+1ml硫酸钠+1ml水

B. 37o C 2h（摇床振荡培养）

C. 2ml甲醛

D. 离心5000r/min，5min 弃上清,

E. 加丙酮5ml(丙酮挥发,加盖处理)

F. 37 o C 振荡萃取10min

G. 离心5min 取上清485nm比色

4. 对照组

A. 0.2g sediment +4ml底物混合液+1ml硫酸钠+1ml水

B. 2ml甲醛

C. 37o C 2h（摇床振荡培养）

D. 离心5000g 5min 弃上清

E. 加丙酮5ml(丙酮挥发,加盖处理)

F. 37 o C振荡萃取10min

G.离心5min（5000r/min），取上清485nm比色

对照组和实验组同时进行,标线制备一次即可