产淀粉酶菌种的鉴定
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的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环 将使目的DNA扩增一倍，这些合成的DNA又可作为 下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使 DNA扩增达106 倍。 .
PCR Cycle 1
Primers
5’
Denaturation 95 ℃ strands separate
.
（二）细菌的16S rRNA分子鉴定
用灭菌牙签挑取单菌落于20 ul PCR管中，加热 10min,离心2min。
反应体系：在一个PCR管中用微量移液枪加入下列 物质的混合液20ul，和5 ul菌液,置于冰上备用。
Taq buffer（10×）
MgCl2（25mM）
dNTP（2.5 mM） Primer Forward（50 mM）
混合液24.5ul
Primer Reverse（50 mM）
ddH2O
震荡，将菌体和反应体系充分混匀
最后加入：rTaq（2U/ul）
0.5ul
PCR反应条件：94℃预变性2 min后，94℃变性1 min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共2530个循环，72℃延伸10min。
.
（三）琼脂糖凝胶电泳
.
实验器材
1. 产淀粉酶的待检菌的平板菌落（提前24小时接 种）；
2. 革兰氏染色全套试剂，载玻片，酒精灯，接种环， 光学显微镜；
3. PCR反应试剂：Taq酶，反应缓冲液，dNTP， 16S rRNA 基因上下游引物，模板（菌落）；
4. 琼脂糖，溴化乙锭，凝胶电泳仪，水平电泳槽， 紫外检测灯，TAE电泳缓冲液；
1. 形态学特征的鉴定 2. 生理生化特征的鉴定 3. 分子特征的鉴定
.
形态学的鉴定
固体平板菌落，固体斜面，半固体穿刺， 液体的培养特征；
显微镜下的细胞形状，革兰氏染色反应， 抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢在细胞 内的位置）、荚膜和鞭毛（鞭毛着生的位 置）等。
.
wenku.baidu.com 分子鉴定
16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA 的基因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的 保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致 的，所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库， 16SrDNA 序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴 定，确定细菌在进化中的位置。
.
PCR的原理和步骤
原理 PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法。
步骤 1. 变性（Denature）：目的双链DNA片段在95℃下解
链； 2. 退火（Anneal）：两种引物在适当温度（59℃ 左右）
下与模板上的互补序列通过氢键配对；
3. 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA
16SrDNA 序列包含10个可变区和与之相间的11个恒定 区。根据恒定区的保守性可以设计出细菌的通用引物， 并且扩增出所有细菌的16SrDNA 片段。可变区因细菌 而异，能够揭示生物物种特征核酸序列，是种属鉴定的 分子基础。
扩增细菌的16SrDNA 基因需要其染色体DNA 作为模 板进行PCR， 可以提取细菌染色体DNA 作为模板，也 可以直接挑取平板上经过活化的菌落做PCR 以达到快速 简便的目的。
1.制胶：配制0.7%琼脂糖溶液20mL，用1×TAE 电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，稍冷后，加入模 具中，插入梳子，待胶凝固；
2.制样：PCR反应结束后，取出PCR管，用微量移 液枪吸取5ul与1ul 6×样品Buffer混合后全部点 入浸于TAE电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔 中; 3.电泳：100V电泳20分钟； 4.染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色； 10min，然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当 在凝胶上出现预期大小的DNA条带（约1.5Kb）， 则认为是PCR阳性，这时将与此电泳样品对应的 PCR反应管放置冰箱短期保存。
实验八 产淀粉酶菌种的鉴定
.
实验目的
1.了解微生物分类与鉴定中的基本程序和常 规实验技术与方法；
2.熟悉16S rRNA基因PCR扩增进行细菌鉴定 的基本原理并初步掌握PCR的操作技术；
3.初步学会网上的有关网站的微生物资源信 息和数据库的使用并利用其进行细菌鉴定 分析。
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实验原理
细菌分类鉴定的方法：
5. 微量移液枪，枪头，PCR管，PCR仪。
.
实验步骤
（一）产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观 察与鉴定 1.培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面 隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等； 2.细菌细胞的显微观察：细胞形状是杆状（长杆或 短杆）还是球状？有无芽孢？有无荚膜？ 3.细菌的革兰氏染色：按照实验二的操作方法进行 （设立标准的革兰氏阳性和阴性菌为对照）。
Taq Taq
3’
3’
5’
Taq polymerase is thermostable
.
PCR Cycle 1
5’ 3’
Taq Taq
Annealing 59 ℃ Primers bind
3’
5’
Forward primer anneals to lower strand Reverse primer anneals to upper strand
.
（四）PCR扩增片段测序 获得的PCR阳性样品由专人送往测序公司进行测序，
大约一周后测序结果可以返回，然后在电脑的相关软件上 进行读序。
（五）序列比对分析
使用NCBI 网站对待测菌的16SrDNA 序列与数据库中各 种菌的16SrDNA 序列进行比对。登陆 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 美国国立生物技术信息中 心网站，使用BLASTn 在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。从Genebank 中选择近与待测 菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的 16SrRNA基因序列, 初步确定待测菌的分类位置。用 Clustal软件将已知分类菌株的16SrRNA序列与待测菌的 16SrRNA序列进行多序列比较。
.
PCR Cycle 1
Extension 72 ℃
Taq copies DNA strand dNTPs
5’ Taq
3’
3’
Taq 5’
Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction
.
琼脂糖凝胶电泳的原理
原理：
带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的 电极泳动的现象。 在本实验中，DNA分子带负电荷，向正极泳动。 影响泳动率的因素： 电荷效应和分子筛效应（即DNA分子本身的大小 和构型）。 在本实验中，分子量越小，泳动越快。
.
实验报告
1.描述你所分离菌的形态学特征：菌落特征， 细胞形态和革兰氏反应等结果；
2.根据PCR产物的测序以及网上比对的结果， 分离菌可以归类到哪一种菌？
.
实验思考
1.细菌的鉴定工作对于发掘微生物种质资源 的意义是什么？
2.为什么说16S rRNA序列分析方法是微生物 分类与鉴定的金标准？
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PCR Cycle 1
Primers
5’
Denaturation 95 ℃ strands separate
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（二）细菌的16S rRNA分子鉴定
用灭菌牙签挑取单菌落于20 ul PCR管中，加热 10min,离心2min。
反应体系：在一个PCR管中用微量移液枪加入下列 物质的混合液20ul，和5 ul菌液,置于冰上备用。
Taq buffer（10×）
MgCl2（25mM）
dNTP（2.5 mM） Primer Forward（50 mM）
混合液24.5ul
Primer Reverse（50 mM）
ddH2O
震荡，将菌体和反应体系充分混匀
最后加入：rTaq（2U/ul）
0.5ul
PCR反应条件：94℃预变性2 min后，94℃变性1 min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共2530个循环，72℃延伸10min。
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（三）琼脂糖凝胶电泳
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实验器材
1. 产淀粉酶的待检菌的平板菌落（提前24小时接 种）；
2. 革兰氏染色全套试剂，载玻片，酒精灯，接种环， 光学显微镜；
3. PCR反应试剂：Taq酶，反应缓冲液，dNTP， 16S rRNA 基因上下游引物，模板（菌落）；
4. 琼脂糖，溴化乙锭，凝胶电泳仪，水平电泳槽， 紫外检测灯，TAE电泳缓冲液；
1. 形态学特征的鉴定 2. 生理生化特征的鉴定 3. 分子特征的鉴定
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形态学的鉴定
固体平板菌落，固体斜面，半固体穿刺， 液体的培养特征；
显微镜下的细胞形状，革兰氏染色反应， 抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢在细胞 内的位置）、荚膜和鞭毛（鞭毛着生的位 置）等。
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wenku.baidu.com 分子鉴定
16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA 的基因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的 保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致 的，所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库， 16SrDNA 序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴 定，确定细菌在进化中的位置。
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PCR的原理和步骤
原理 PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法。
步骤 1. 变性（Denature）：目的双链DNA片段在95℃下解
链； 2. 退火（Anneal）：两种引物在适当温度（59℃ 左右）
下与模板上的互补序列通过氢键配对；
3. 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA
16SrDNA 序列包含10个可变区和与之相间的11个恒定 区。根据恒定区的保守性可以设计出细菌的通用引物， 并且扩增出所有细菌的16SrDNA 片段。可变区因细菌 而异，能够揭示生物物种特征核酸序列，是种属鉴定的 分子基础。
扩增细菌的16SrDNA 基因需要其染色体DNA 作为模 板进行PCR， 可以提取细菌染色体DNA 作为模板，也 可以直接挑取平板上经过活化的菌落做PCR 以达到快速 简便的目的。
1.制胶：配制0.7%琼脂糖溶液20mL，用1×TAE 电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，稍冷后，加入模 具中，插入梳子，待胶凝固；
2.制样：PCR反应结束后，取出PCR管，用微量移 液枪吸取5ul与1ul 6×样品Buffer混合后全部点 入浸于TAE电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔 中; 3.电泳：100V电泳20分钟； 4.染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色； 10min，然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当 在凝胶上出现预期大小的DNA条带（约1.5Kb）， 则认为是PCR阳性，这时将与此电泳样品对应的 PCR反应管放置冰箱短期保存。
实验八 产淀粉酶菌种的鉴定
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实验目的
1.了解微生物分类与鉴定中的基本程序和常 规实验技术与方法；
2.熟悉16S rRNA基因PCR扩增进行细菌鉴定 的基本原理并初步掌握PCR的操作技术；
3.初步学会网上的有关网站的微生物资源信 息和数据库的使用并利用其进行细菌鉴定 分析。
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实验原理
细菌分类鉴定的方法：
5. 微量移液枪，枪头，PCR管，PCR仪。
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实验步骤
（一）产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观 察与鉴定 1.培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面 隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等； 2.细菌细胞的显微观察：细胞形状是杆状（长杆或 短杆）还是球状？有无芽孢？有无荚膜？ 3.细菌的革兰氏染色：按照实验二的操作方法进行 （设立标准的革兰氏阳性和阴性菌为对照）。
Taq Taq
3’
3’
5’
Taq polymerase is thermostable
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PCR Cycle 1
5’ 3’
Taq Taq
Annealing 59 ℃ Primers bind
3’
5’
Forward primer anneals to lower strand Reverse primer anneals to upper strand
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（四）PCR扩增片段测序 获得的PCR阳性样品由专人送往测序公司进行测序，
大约一周后测序结果可以返回，然后在电脑的相关软件上 进行读序。
（五）序列比对分析
使用NCBI 网站对待测菌的16SrDNA 序列与数据库中各 种菌的16SrDNA 序列进行比对。登陆 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 美国国立生物技术信息中 心网站，使用BLASTn 在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。从Genebank 中选择近与待测 菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的 16SrRNA基因序列, 初步确定待测菌的分类位置。用 Clustal软件将已知分类菌株的16SrRNA序列与待测菌的 16SrRNA序列进行多序列比较。
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PCR Cycle 1
Extension 72 ℃
Taq copies DNA strand dNTPs
5’ Taq
3’
3’
Taq 5’
Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction
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琼脂糖凝胶电泳的原理
原理：
带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的 电极泳动的现象。 在本实验中，DNA分子带负电荷，向正极泳动。 影响泳动率的因素： 电荷效应和分子筛效应（即DNA分子本身的大小 和构型）。 在本实验中，分子量越小，泳动越快。
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实验报告
1.描述你所分离菌的形态学特征：菌落特征， 细胞形态和革兰氏反应等结果；
2.根据PCR产物的测序以及网上比对的结果， 分离菌可以归类到哪一种菌？
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实验思考
1.细菌的鉴定工作对于发掘微生物种质资源 的意义是什么？
2.为什么说16S rRNA序列分析方法是微生物 分类与鉴定的金标准？
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