色谱法Tswett叶绿素分离试验

超临界流体色谱(SFC)
吸附色谱
分配色谱（DC）
2.按分离原理分类 离子交换色谱（IEC) 分子排阻色谱(MEC） 亲和色谱 柱色谱 (CC） 薄层色谱（TLC） 平面色谱(PC） 纸色谱（PC)
3.根据实验操
作形式
薄膜色谱（TFC）
分离效能高
三、色谱法的特点
分离与分析功能兼备 自动化程度高 应用范围广
2．吸附剂 （1）硅胶 (SiO2· XH2O)
A.吸附机制：表面有许多硅羟基（-Si-OH）的氢键作用
B.吸附活性 C.失活或脱活
D.活化
硅胶活性与含水量的关系
硅胶含水量% 0 活度级 I 活性 大
5
15 25
II
III IV
38
V
小
（2）氧化铝
A.吸附机制:其表面铝羟基（Al-OH）的氢键作用 B.活性 氧化铝含水量% 活度级 活性
第1节 色谱法概述 一、色谱法
Tswett叶绿素分离实验
（1）色谱：植物色素经溶剂冲洗分离后如同白光色散成七 色光带的现象
（2) 色谱法：用于产生色谱的分离方法 （3）色谱柱（chromatographic column） 装有用于分离的填充物的细长管（如玻璃管、不锈钢管） （4)固定相（stationary phase） 固体固定相 液体固定相 液体流动相 （5）流动相（mobile phase） 气体流动相 超临界流体流动相
①湿法装柱
②干法装柱
（2）加样
①干法加样
②湿法加样 （3）洗脱 ①洗脱剂 一种溶剂或几种溶剂按一定比例组成混合溶剂 ②操作要求 A.保持吸附层上方有一定量的洗脱剂，防止断层和旁流 B.控制洗脱剂的流速（5～10滴/min)
（4）收集 ①等份收集 (亦可用自动收集器)
②按变换洗脱剂收集
(2）选用方法 水溶性样品 -------水溶液为流动相 非水溶性样品 ------有机溶剂为流动相
(3）常用的流动相
四氢呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷和 水等
0
5 15
I
II III
大
25
38
IV
V 小
C.氧化铝分类及应用范围
氧化铝种类 碱性氧化铝
pH
应用范围
9～10 分离碱性和中性化合物，如生物碱。 分离酸性、中性和碱性化合物，如生物 碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸碱 中不稳定的酯类、苷类等化合物。 分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸 性色素。
中性氧化铝
（5）检验 可以为后续操作
二、凝胶柱色谱技术 1．分离原理 （1）凝胶
(2)分离原理
凝胶的孔穴大小与 被分离组分大小相当，尺 寸大的组分分子可以渗入 到凝胶的大孔内，但进不 了小孔，甚至于完全被排 斥先流出色谱柱。尺寸小 的组分分子，大孔小孔都 可以渗进去，最后流出。
2．固定相 (1)无机凝胶又称硬质凝胶----多孔硅胶、多孔玻璃珠 性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温， 使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱分离效能较低
第2节 经典柱色谱技术 一、液-固吸附柱色谱技术 1．分离原理 （1）液-固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液 体的柱色谱法 （2）分离机制:吸附剂表面对不同组分吸附力的不同和流动相
对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最 终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中 停留的时间即保留时间）不同而达到分离。 （3）应用:分离酸性及中性化合物 (如醇类和芳香烃等)
第8章 经典色谱分离实用技术 学习目标
知识目标
掌握吸附薄层色谱和纸色谱分离原理、常用分离参 数和系统适用性指标；熟悉经典柱色谱、薄层色谱和纸 色谱操作方法；了解色谱的分类和吸附薄层色谱、纸色 谱、经典柱色谱的色谱条件选择原则。
技能目标
掌握吸附柱色谱制备技术和薄层板制备、点样、展 开和显色检视等操作技术；熟悉薄层色谱、纸色谱的仪 器和材料；了解纸色谱和经典柱色谱的操作规程。
7.5
Baidu Nhomakorabea酸性氧化铝
4～5
（3）聚酰胺 A.吸附机制：通过分子内的酰胺基与酚、酸、硝基、醌类化
合物形成氢键而产生吸附作用
B.应用范围：适合于含-OH 的天然产物的有效成分分离 （4）大孔吸附树脂 A.吸附机制：大孔网状结构的高分子化合物，不溶于酸、 碱及有机溶剂，吸附性与筛分性原理相结合 B.应用范围：主要用于水溶性化合物(如皂苷）的分离纯 化
3．流动相(又称为洗脱剂 ) （1）流动相影响因素 A.被测物质的结构、性质 物质的结构
官能团极性与数目 结构空间排列
常见官能团的极性由小到大的顺序是：烷烃＜烯烃＜醚类＜ 硝基化合物＜酯类＜酮类＜醛类＜硫醇＜胺类＜酰胺＜醇
类＜酚类＜羧酸类。
B.流动相极性: 相似相溶 C.吸附剂活性
（2）如何选择流动相？
(2)有机凝胶又称半硬质凝胶
性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相， 有一定可压缩性，可填得紧密，柱分离效能较高。但在有 机溶剂中有轻度膨胀。 (3)新型凝胶 ---葡萄聚糖凝胶
3．流动相 （1）要求
流动相必须与凝胶本身非常相似，能溶解样品，浸 润凝胶，且具有较低的黏度，有利于大分子的扩散
(6）色谱分离本质:
利用混合物中各组分在流动相和固定相之间相互作用力 （如溶解能力、吸附力、极性、亲和力等）的强弱不同， 而使各组分在色谱柱中分别以不同的速度移动而达到分离 的定性与定量分析的方法。
二、色谱法分类
液相色谱(LC) 1.流动相状态 气相色谱(GC)
液-固色谱(LSC) 液-液色谱(LLC) 气-固色谱(GSC) 气-液色谱(GLC)
想一想 在吸附色谱 中，以硅胶为固定相， 当用三氯甲烷为流动 相时，样品中某些组 分保留时间太短，若 改用三氯甲烷–甲醇 （1:1）时，则样品中 各组分的保留时间是 变长，还是变得更短？ 为什么？
最佳方案总是实验确定
4．吸附柱色谱操作技术 （1）装柱
A.质量要求
装柱之前，先将空柱洗净干燥，再将空柱垂直固定 在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团 脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平铺上一层厚 0.5~1cm的洗过、干燥石英砂，有助于分离时色层边缘整 齐，加强分离效果。柱的长度与直径比一般为10 ~ 20:1。 色谱柱的填装要均匀，不能有气泡。 B .装法