一株纤维素分解菌的分离与筛选

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生
物
技
术
第 !! 卷第 , 期
需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的酶蛋白 多 !"" 倍。这是影响纤维素酶实际应用的重 要原因之一。因而， 筛选纤维素酶比活力高 的菌株无疑有着重要的意义。 本文采用定性、 半定量及定量的层层推 进的筛选法从垃圾堆肥中筛选到 ! 株产纤维 素酶活较高的曲霉 # $ %。将 # $ % 与产纤维 素酶的绿色木霉 （ !"#$%&’(")* +, ） &’()(*!! 进行了参比试验， 对所做的筛选工作进行评 定。
发酵 23， 浸提得粗酶液， 测定各纤维素酶活 力。结果见表 7。
表7 固体曲发酵情况比较
01 !$ ’())*)+,( => %"2 7"! -./’() => 7"G 2"< 菌株 #$% -L4"4H11 0; => 4I"! 1%"% ?@=> 7"! %"2
图 ! 不同碳源对 # $ % 产酶的影响 注： 分别以 ! !$ & 麸皮表示 !$ ’())*)+,( & 麸皮， $ ’())*)+,(、 -./’() 为底物测定的 01 酶活力以图例 中的 !$ ’())*)+,(、 -./’() 表示。发酵第 23 测定上 述结果， 从表中结果来看， 所试验的一系列纤维 类碳源均能不同程度的促进纤维素酶类的合成， 而葡萄糖则不能。
图7
固体曲发酵情况比较
试验了不同培养 !"4 产酶过程的系列变化： 时间纤维素酶活力、 菌体生长量、 发酵液还原 糖含量、 培养 !78 后开始收获， 以 56 的变化， 后每 隔 1!8 收 获 1 次， 直 至 1778 后 收 获 完 毕。各参量变化见表 !。
表! 产酶过程的系列变化
?@- 生长量 #/+:A,, 9/:( 0; （ 3） <"1=> <"1=> （干重 1<:B） 1 ! 4 7 2 % G !< !% 4H 7< 4I 4 % 2 H H 7 <"1 4"7H 4"I1 2"47 1"1! <"1 发酵液还原糖 含量变化 08ACB( +D ,*BAE （<"1:B F :)） 1"% 4"% 4"H 7"4 7"I 7"I 终点 56 %"H H"< %"H %"H %"H H"<
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实验结果
从垃圾堆肥中筛选到分解纤 ,)! 菌种筛选： 将纯化菌株点种在刚果 维素的菌株共 (+ 株， 红纤维素平板上， 通过多次反复实验比较， 得 （表 !） 。经 到 !" 株透明圈直径较大的菌株 液体发酵复选得到 ! 株纤维素酶活力较高的 霉菌， 初步鉴定为曲霉 （命名为 # $ %） 。为了 证明产透明圈菌株确实为纤维素酶产生菌， 采用含纤维素酶 （北京经科化学试剂公司） 的 滤纸片进行阳性对照 （图 !） ， 并点种不产纤 维素酶的大肠杆菌于刚果红纤维素平板作阴 性对照。结果证明产透明圈菌株确实为纤维 素酶产生菌。液体发酵测定纤维素相对酶活 力 （以反应产生的还原糖表示） 的结果更证实 。 了这一点 （见表 !）
发酵基础培养基 &! # $ % $ ’())*)+,( & 麸皮 -L4"4H11 发酵基础培养基 #$% & -./’() -L4N4H11 发酵基础培养基 #$% & 0J0 -L4"4H11 发酵第 23 测定上述酶活力
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讨论
注： 以 0J0 为碳源。
图4
产酶过程的系列变化
从图 4 可看出第 73 K %3 是 # $ % 0; 酶的 产酶高峰， 约出现在对数生长期与稳定期期 间。还原糖 含 量 变 化 与 0; 酶 呈 平 行 关 系。 而 ?@- 酶活力、 56 变化很小。 为了评 !"7 筛选菌株与标准菌株产酶比较： 定筛选工作， 将 # $ % 与标准菌株 -L4"4H11 同时进行固体、 液体发酵， 然后比较纤维素酶 活力大小。 固体曲于 !GM !"7"1 固体曲发酵情况比较：
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材料与方法
!)! 菌种 自垃圾堆肥的 (+ 株分解 !)!)! 试验菌种： 纤维素的菌株中筛选到纤维素酶活较高的曲 霉 # $ %。 绿色木霉 （ !"#$%&’(")* !)!), 对 照 菌 种： 由中科院微生物菌种保藏中心 &’()(*!!， +, ） 为产纤维素酶的专用菌株。 ----. 惠赠， !), 培养基 参 !),)! 选择培养基： /0123 纤维素培养基： 看 《土壤微生物实验法》 科学出版社， !+4(。 纤维糊精培养 !),), 菌 种 纯 化 培 养 基： 〔,〕 基 ； 鉴 别 培 养 基：刚 果 红 纤 维 素 培 养 〔(， 5〕 基 。 蛋白胨 ")(6 ， 硫铵 !),)( 液体发酵培养基： 酵 母 膏 ")"76 ， "),6 ， 89, :;5")56 ， -<-=,・ ・ ,9, ; ")"(6 ， .>’;5 *9, ; ")"(6 ， ?@AAB $ 4" 然 后 添 加 不 同 碳 源， ")",6为 基 础 培 养 基， !,!C ， ,"DEB。 麸 皮 7">， !),)5 固 体 曲 培 养 基： 89, :;5 ・*9, ; ")",7>， （ F95 ） 蒸 ")"7>， .>’;5 , ’;5 !>， 自然 G9， 馏水 , 倍， !,!C ， !H。 将不同稀释度的样品悬液接 !)( 菌种筛选： 种装有 /0123 纤维素培养基的试管， ("C 培 养至滤纸条上出现溃烂斑。从滤纸溃烂处挑 取菌落于纤维糊精培养基平板划线分离， 得 到纯化的单菌落。将单菌落点种刚果红纤维 素鉴别培养基， 用 !F 9-= 固定 ("C 培养 54H， 分解纤维素的透明圈， 测量透明圈直径大小， 进行初选。将初选菌株液体发酵测定酶活力 复选， 筛选出纤维素酶高产菌株。 培养 适 当 时 间 的 发 酵 液 !)5 酶活力测定： 上清液即为用于 ("""> I DEB， 5C 离心 !7DEB，
（ N<.’!’-’-:） （!） ； 即 "/ -， <[ 酶， 3 / 葡聚糖 葡萄糖苷糖酶。 内切酶； （.） / ^DDV 提出 " 三类酶在发挥作用时表现出协同作用， 尤其 是 <- f <[ 的组合， 表现出很强的分解活性， 单独作用则效果极差。纤维素的酶解是一个 复杂的过程， 其真正的酶解机制还不完全清 楚。 纤维素酶的比活力一般都很低， 因而产 酶成本高。据估计， 纤维素水解成葡萄糖所
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中图分类号： c:. / ..-
文献标识码： O
文章编号： （!((-） -((3 / .--d (! / ((!; / (3
一株纤维素分解菌的分离与筛选
王晓芳， 徐旭士， 吴敏， 王冠， 刘清梅
（南京师范大学生命科学学院， 江苏 南京 !-((:;） 摘 要： 以新华滤纸为唯一碳源， 从垃圾堆肥中筛选能够分解纤维素的菌株共 .: 株， 采用刚果红鉴别培 进行液体培养， 测定酶活， 得到 - 株酶活较 养基进行识别， 获取透明圈较大的菌株 -( 株。在此基础上， 高的曲霉 @ / （ 。将 * / & 与绿色木霉 （ +%’,-./$%01 "# ） 以对筛选 & !"#$%&’(()" "# ） O?.’.;-- 进行了参比试验， 工作进行评定。经过固体、 液体发酵对比试验， 发现 @ / & 与 O?.’.;-- 有相近的产酶性能。 @ / & 在固、 而 O?.’.;-- 则分别为 -&’&RI 与 -*’;RI。且 @ / & 较 O?.’.;-- 有 液发酵中酶活分别达到 .:’!RI、 -3’:RI， 更强的液化 <e< 的能力， 而 O?.’.;-- 则需 :&C。 @ / & 在 !3C 内即能使 .b <e< 完全液化， 关键词： 筛选； 纤维素降解菌； 纤维素酶
液体发酵情况比较
菌株 0; （ =>） 17"I 12"H 4"G 4"! 2"H H 0（ 1 =>） !$ ’())*)+,( 2"% 7"7 !"% 4"! 1"1 !"G -./’() <"I < <"I 1"< <"G <"G ?@（ =>） 4"H 4"H 1"7 1"7 <"G7 1"1
发酵第 23 测定上述结果。从表中来看， 而 # $ % 较 -L4"4H11 有 更 高 的 0; 酶 活 力， 但差异不很显 ?@- 酶活力则小于 -L4"4H11， 著。 用 4 组培养 !"7"! 液体发酵产酶情况比较： 基液体发酵， # $ % 与 -L4"4H11 进行对比实 验。
表2
培养基
自从 -:(& 年从蜗牛消化液中发现纤维 素酶以来， 人们在纤维素的生物转化方面进 〔-〕 。纤维素酶是降解纤维素 行了大量的研究 生成葡萄糖的一组酶的总称， 它往往不是单 种酶， 而是起协同作用的多组分酶系， 大致分 〔-〕 为三群 （-） ： 即"/ -， <- 酶， 3 葡聚糖外切酶
收稿日期： 修回日期： !((( / (: / !;； !((- / (- / -( 作者简介： 王晓芳 （-:;. / ） ， 女， 硕士。
表 ! 不同菌株透明圈的大小与相对酶活力的关系
菌株 ! , ( 5 7 % * 4 + !" 相对酶活 （"T!D>I D=） ,)+ !), !)5 !)* !), (, !)5 ,5)( !), !)7 透明圈 （ ND） ( ,)5 !)4 ,)% !)7 ,)4 5)" ,)4 5)" ()7
注： 选定 % 作进一步研 ! $ 7 为细菌， % $ !" 为霉菌， 究。
图 ! < 纤维素分解菌点种纤维素刚果红平板所产透明圈； 1 含纤维素酶的滤纸片在纤维素刚果红平 板上所产透明圈。透明圈 ! 的酶活达 !! RS。
!<<1 年 7 月
一株纤维素分解菌的分离与筛选
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一般来 !"! 不同碳源对 # $ % 产酶的影响： 说， 真菌纤维素酶是诱导酶， 不同碳源对纤维 素酶的合成具有显著影响， 因而试验了一系 列碳源对 # $ % 产酶的影响， 结果见图 !。
〔4， 7〕 刚果红纤维素平板透明圈筛选法 明 显优于传统的筛选法。该法可用于识别产纤 维素酶的菌株， 还可用于初步判定酶活性高 低。产酶越多， 透明圈越大， 产酶越快， 透明 圈出现越早。然而， 虽然透明圈大小直接反 映了酶浓度的高低， 但不能完全代表菌株产 〔7〕 酶能力， 对此 9(AO8(E 和 P++3 指出液体样 品的酶浓度与透明圈的直径成线性关系， 可 以对酶活进行初步定量。因而仅以水解圈大 小作为菌株产纤维素酶活力大小的唯一定量 指标是不太可靠的， 这从表 1 结果也可以看 出。其原因是多方面的， 如固体和液体培养 条件不同； 不同菌株具有不同的生长和产酶 速度和不同的纤维素酶系； 菌苔大小及在平 板上堆积情况的差异等都会造成透明圈大小 与液体发酵酶活结果的不完全一致。所以液 体发酵复筛必不可少。只有测定菌株的最佳
测定的粗酶液。!> 固体曲湿料加 !"D= 去离 子水， 纱 布 过 滤， ("C 浸 提 %DEB， ("""J I DEB 上清液即为用于测定的固体曲酶液。 !7DEB， （ -! ） ： 取 !D= 粗酶液 !)5)! 外切纤维素酶活 与 !D= ,6 （ K I L） 的 &MENA=， （ 溶于 $ ! NA==0=23A ")"7. 的柠檬酸 $ 柠檬酸钠缓冲液， G95)4） 离心取上清测定 还 原 糖 （ /F’ 7"C 反应 ,H， 〔7〕 法 ） ， 以葡萄糖计。 （ -O ） ： 取适当稀释酶 !)5), 内切纤维素酶活 液 "),D=， 加 入 ")7D= !6 -.- 溶 液 （溶 于 ， ")"7. 的柠檬酸 $ 柠檬酸钠缓冲液， G95)4） 加入 /F’ 终止反应， 沸水浴 7"C 反应 ("DEB， 测还原糖。 7DEB， （ P:&） ： 取 7"D> （!ND Q !)5)( 总纤维素酶活 新华滤纸， 加 !D= ")"7. 柠檬酸 $ 柠檬 %ND） ， 加入适当稀释酶液 酸钠 液 冲 液 （ G95)4 ） 加入 /F’ 终止反应， ")7D=， 7"C 反应 %"DEB， 沸水浴 7DEB， 测还原糖。 以上酶活均扣除发酵液中的还原糖后计 算酶活力， 酶活采用国际单位， 在上述各条件 的葡萄糖定义为一个 下每分钟每产生 ! D2= " 酶活单位 （ RS） 。 〔%〕 采用苯酚 $ 硫酸法 。 !)7 总糖测定：