硬脂酸镁的微生物限度检查综述

硬脂酸镁的微生物限度检查

一、概述

本报告按USP31中“〈61-62〉非灭菌产品的微生物学检查”的规定，对硬脂酸美的微生物学检查方法学考察。参照企业提供标准，通过测试实验制定适合于本品的微生物学检查的方法。

企业提供标准：

总需气菌数（TAMC）不得过1000 cfu/g；霉菌及酵母菌总数（TYMC）不得过500 cfu/g；每1g样品不得检出大肠埃希菌；每10g样品不得检出沙门氏菌。

二、方法学

1、培养基及试剂

实验用培养基及缓冲液均符合USP规定。

BP：pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液

CA：溴化十六烷基三甲铵

MCA：麦康凯琼脂

MCB：麦康凯肉汤

MSA：甘露醇盐琼脂

RVS：RV沙门菌增菌肉汤

SDA：沙氏葡萄糖琼脂

SDB：沙氏葡萄糖肉汤

TSA：大豆胰酪胨琼脂

TSB：大豆胰酪胨肉汤

XLD：赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂

2、实验菌株

黑曲霉ATCC16404

枯草芽孢杆菌ATCC6633，CMCC(B)63501

白色念珠菌ATCC10231，CMCC(F)98001

大肠埃希菌ATCC8739

铜绿假单胞菌ATCC9027

霍乱沙门氏菌ATCC14028

金黄色葡萄球菌ATCC6538，CMCC(B)26003

本实验取用中国临床医学菌种保存中心（CMCC）的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌。这三株菌也来源于ATCC。实验用菌株，自种子批启用传代不超过5次。黑曲霉为3个月内制得的4℃保存的孢子悬液，可直接稀释使用。参照表格2，将其他6株菌分别接种至规定的培养条件培养。上述各菌分别以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10倍稀释至大约50-100 cfu/mL的浓度，备用。参照表格2各菌株的生长条件，采用浇碟法测定稀释得到的最终菌液浓度。

3、方法学

本部分主要包括培养基特性测试和方法的适用性考察。

3.1 培养基特性测试

按照USP31中“〈61-62〉非灭菌产品的微生物学检查”的规定，与已经通过测试验证的参比培养基（MⅠ）相比，当微生物限度检查用培养基（MⅡ）符合以下标准，则用于硬脂酸美的微生物学检验：

a.固体培养基的促生长能力：与MⅠ相比，MⅡ的回收率应在50%-200%之间。

b.固体培养基指示能力：与MⅠ相比，规定菌株在MⅡ的生长特征应与之类似。

c.液体培养基促生长能力：与MⅠ相比，规定菌株在MⅡ有明显浑浊。

d.抑制能力：无论是固体培养基或是液体培养基，规定菌株在其不得生长。

对于固体培养基，通常采用平皿计数法(包括浇碟法和表面接种法)来评价培养基特性，每次平行测试两皿，最后取平均数为计算结果。培养基特性测试结果见表格3-表格5。

3.2 方法适用性

当微生物学检查方法符合以下要求时，说明该方法适用该品种：

a.样品供试液不得抑制测试菌株的生长。计数实验中，测试微生物在供试样品中的回收率不得低于接种量的50%；控制菌检查中，测试菌在含有规定量供试品的环境中应可以生长。

b.样品自身含有的微生物水平不得干扰菌株回收实验。

供试液制备：

以70%的乙醇擦拭供试品的外包装，使自然挥干。由于硬脂酸美是一种脂溶性物质，因此用表面活性剂吐温-80将其溶解。无菌操作取10g 硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入一定量的45℃灭菌的含1%吐温-80的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，振摇使分散均匀，制成1:40的供试液。 计数方法适用性：

a. 实验组：取4个直径为9cm 的无菌平皿。其中两个平皿中加入1:40供试液4mL 和50-100cfu 测试菌，取另两平皿加入1:40供试液2mL 和50-100cfu 测试菌。每个平皿倾注45℃表格2中的规定培养基，摇匀。待琼脂凝固后，参照表格2的条件倒置培养。5株测试菌（黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）均进行该测试。

b. 样品组：取8个直径为9cm 的无菌平皿。其中两个平皿中分别加入1:40供试液4mL 和2mL ，每个平皿倾注45℃ TSA ；取另两平皿加入1:40供试液4mL 和2mL ，每个平皿倾注45℃ SDA ；各平行测试两皿。参照表格2培养。记录平皿计数结果，计算测试菌回收率。

c. 菌液组：计数方法适用性检查中测试菌包括5株测试菌，分别为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。参考表格2培养条件，采用浇碟法计数，确定接种量。

d. 回收率计算公式如下：

100%C

B

-A

⨯=回收率 A-实验组平均菌落数；B-样品组平均菌落数；C-菌液组平均菌落数。

控制菌测试方法适用性： 大肠埃希菌

a. 预培养：取1:40供试液40mL （相当于1g ）至400mL 灭菌TSB ，混匀，置30至35℃培养18至24小时。

b. 阳性组1：接种50-100cfu 大肠埃希菌至灭菌TSB 中，置30至35℃培养18至24小时。

c. 实验组1：取1:40供试液40mL （相当于1g ）和50-100cfu 大肠埃希菌至400mL 灭菌TSB ，混匀，置30至35℃培养18至24小时。

d.阳性组2：取1mL灭菌TSB和50-100cfu大肠埃希菌至100mL灭菌麦康凯肉

汤中，置42至44℃培养24至48小时；划线接种至麦康凯琼脂，30至35℃培养18至72小时。

e.实验组2：取TSB预培养物1mL和50-100cfu大肠埃希菌至100mL灭菌麦康

凯肉汤中，置42至44℃培养24至48小时。划线接种至麦康凯琼脂，30至35℃培养18至72小时。

沙门氏菌

a.预培养：无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入45℃的

400mL1%吐温-80的灭菌TSB，振摇使分散均匀，置30至35℃培养18至24小时。

b.阳性组1：接种50-100cfu霍乱沙门氏菌至灭菌的1%吐温-80的TSB中，置

30至35℃培养18至24小时。

c.实验组1：无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入45℃的400mL

灭菌的1%吐温-80的TSB，振摇使分散均匀。加入50-100cfu霍乱沙门氏菌置30至35℃培养18至24小时。

d.阳性组2：取0.1mL灭菌TSB（含1%吐温-80）和50-100cfu霍乱沙门氏菌至

10mL灭菌RVS肉汤中，30至35℃培养18至24小时；划线接种至XLD琼脂，30至35℃培养18至48小时。

e.实验组2：取TSB（含1%吐温-80）预培养物0.1mL和50-100cfu霍乱沙门氏

菌至10mL灭菌RVS肉汤中，30至35℃培养18至24小时；划线接种至XLD 琼脂，30至35℃培养18至48小时。

4、讨论

表格3至表格5表明本品涉及到所有培养基均符合微生物学检查用的要求。培养基的灭菌方式各异，参见表格1。表格6至表格8表明硬脂酸美并不抑制各株测试菌的生长。计数实验中，胶囊壳自身的颜色使得琼脂清晰度降低，使得对3株细菌（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）的计数较为困难，但并不影响黑曲霉和酵母菌的计数。因此，通过方法适用性实验，确定以增加培养基体积的方式使得平皿计数可行。控制菌检查方法依照常规方法即可满足。本品微生物学检查方法的具体内容在后续细述，详见“微生物学检查检验操作程