蔗糖酶的提取及活力测定

啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力测定原理
1、细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。
2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理
（1）DNS试剂+ D-葡萄糖 氨基化合物
（还原糖） （棕红色）
（2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可用于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。
（3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。
试剂与器材
恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液 6. 乙酸乙酯

操作方法
① 细胞破壁→抽提→两次乙醇分级→透析→装柱→洗涤→洗脱→收集酶活力峰→制冻干粉
② 制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活力
③ 测定三种酶样品的蛋白浓度
④ 计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率
⑤ 用双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值
关键步骤与注意事项
① 乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样
② 装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直
③ 分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向
④ 在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。
⑤ 酶活力测定及作图一定要准确。