微粒体提取及酶促

微粒体提取及酶促挑取单克隆(菌斑)至10mLSD-His（2%Glucose）中，30℃，250rpm，48h至stationaryphase；取10mL，4000rpm离心5min，用10mlddH2O重悬菌体，4000rpm 离心5min；重复步骤3两次；加入50mL诱导表达培养基YPL（1%的yeastextract，2%的peptone，2%的galactose半乳糖），30℃，12-16h；4000g，离心5min，用5mLTE+KCl（0.1MKCl溶于TE）重悬细胞（1/10YPL体积），室温放置5min；离心收集细胞，用500uL冰浴的TESB（0.6M 山梨醇溶于TE）（1mLTESB/100mLYPL体积）重悬，转入15ml离心管；小心加入玻璃珠，使其刚好接触细胞悬浮液表面，4度用力摇打破碎细胞（离心管的体积至少是细胞悬浮液的4倍），直至细胞完全破碎（约半小时）；破碎好的细胞置于冰上，加入1mL的TESB，洗玻璃珠，回收上清，重复2-4次收集上清至新管。4度，12000rpm离心15min；取上清加入2倍体积(TESB+0.225MNaCl+0.15g/mlPEG4000)，冰浴15min；4度，12000rpm离心15min，弃上清；加入300-500uLTEG溶解沉淀；每500ug蛋白，加入50mMTris-HCl(pH7.4),1mMNADPH，5μMflavinadeninedinucleotide(FAD),5μMflavinmono-nucleotide(FMN),5mMglucose -6-phosphate,1unitglucose-6-phosphatedehydrogenase）,加底物至100μM，30℃反应至少1h；加入等体积乙酸乙酯混匀，12000rpm离心2min，取上层，氮气吹干，用50ul乙酸乙酯溶解，用于HPLC分析。