丹参酮_A在大鼠肝微粒体酶中的代谢动力学_毕惠嫦

M etabol ic k inetics of tan sh inone
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A
in ra t l iver m icrosoma l enzym e
( 11 In stitu te of C lin ica l Pha rm aco logy, Schoo l of Pha rm aceu tica l Sciences, Sun Ya t 2sen U n iversity, Guangzhou 510080 Ch ina; 2. D ep a rtm en t of Pha rm acy, F irst A ffilia ted Ho sp ita l, Sun Ya t 2sen U n iversity, Guangzhou 510080, Ch ina )
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中草药 Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs 第 38 卷第 6 期 2007 年 6 月
丹参酮
A
在大鼠肝微粒体酶中的代谢动力学
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毕惠嫦1 , 和 凡1 , 温莹莹1 , 陈 孝2 , 黄 民1
( 11 中山大学药学院临床药理研究所, 广东 广州 510080; 21 中山大学附属第一医院 药学部, 广东 广州 510080)
摘 要: 目的 研究丹参酮 A 在大鼠肝微粒体酶中的代谢, 以及选择性细胞色素 P450 (CYP ) 酶抑制剂对其代谢 的影响。 方法 超速离心法制备大鼠肝微粒体, 采用高效液相2质谱联用方法测定孵育液中丹参酮 A 原形药物的
1 2 1 B I H u i2chang , H E Fan , W EN Y ing 2ying , CH EN X iao , HU AN G M in
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Abstract: O bjective To study the m etabo lic k inet ics of tan sh inone A and the effect s of select ive CYP 450 inh ib ito rs on the m etabo lism of tan sh inone A in ra t liver m icro som a l enzym e. M ethods R a t liver m icro som es w ere p rep a red by u sing u lt racen t rifuga t ion m ethod. T an sh inone A concen t ra t ion in the incuba t ion poo l w a s determ ined by L C L C M S m ethod. T he M ichaelis2 M en ten p a ram eters K m and V m ax in 2 ra t liver m icro som es w ere in it ia lly est im a ted by ana lyzing L inew eave B ru rk p lo t. T he clea rance (CL in t ) w a s ca lcu la ted fo r in v itro enzym e to tan sh inone A. V a riou s select ive CYP inh ib ito rs w ere u sed to invest iga te their inh ib ito ry effect s on the m etabo lism of tan sh inone A and the p rincip a l CYP isofo rm s invo lved in tan sh inone A m etabo lic ring. Results T he V m ax , K m , and CL in t of tan sh inone A w ere ( 1. 20 ± 0. 18 ) nm o l (m in ・m g ) , ( 4. 35 ± 0. 67 ) nm o l mL , and ( 0. 28 ± 0. 06 ) mL (m in ・m g ) , resp ect ively. T he m etabo lism of tan sh inone A w a s sign ifican t ly inh ib ited by t iclop id ine and ketoconazo le. Q u in id ine cou ld inh ib it the m etabo lism of tan sh inone A , w h ile the o ther inh ib ito rs show ed lit t le inh ib ito ry effect on the m etabo lism of tan sh inone A. Conclus ion It is show n tha t CYP 2C 19 and CYP3A 1 a re invo lved in the m etabo lism of tan sh inone A and CYP2D 6 con t ribu te to the m etabo lism to som e ex ten t. T heir select ive CYP inh ib ito rs m ay have po ten t ia l inh ib it ion on m etabo lism of tan sh inone A and m ake the efficacy o r tox icity increa sed. Key words: tan sh inone A ; m etabo lism ; liver m icro som es; CYP
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浓度。 研究丹参酮 A 的酶促动力学, 推导出药物米氏常数 ( K m ) 和最大反应速度 (V m ax ) ; 并计算体外酶对药物的 清除率 (CL int ) 。 同时观察不同浓度和不同种类的 CYP 酶特异性抑制剂对丹参酮 A 代谢的影响。 结果 丹参酮 A 在 大 鼠 肝 微 粒 体 酶 中 的 V m ax 为 ( 1 120 ± 0 118 ) nm o l (m in ・m g ) ; K m 为 ( 4 135 ± 0 167 ) nm o l mL ; CL int 为 ( 0128±0106) mL (m in ・m g ) 。噻氯匹啶和酮康唑能够显著抑制丹参酮 A 的代谢, 奎尼丁对丹参酮 A 的代谢也 有一定的抑制作用, 而其他 CYP 酶抑制剂对丹参酮 A 的代谢无明显影响。 结论 CYP2C 19 和 CYP3A 1 主要参 与了丹参酮 A 的代谢, CYP 2D 6 也起到了部分代谢作用; 这些 CYP 酶的抑制剂可能使丹参酮 A 的代谢受到抑 制, 造成药物药效或毒性的增加。 关键词: 丹参酮 A ; 代谢; 肝微粒体; 细胞色素 P 450 (CYP ) 中图分类号: R 285161 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670 ( 2007) 06 0882 05
m RNA 和蛋白表达水平以及加用川芎嗪后对这些
m RNA 和蛋白表达增加, 经 U VB 照射再加川芎嗪
处理后, 两种调控分子的 m RNA 和蛋白表达水平 均较单纯 U VB 照射组低, 说明川芎嗪降低细胞中
CPD s 水平的光保护作用机制可能与下调这些相关
修复基因的 m RNA 和蛋白表达有关。 总之, H aCaT 细胞对 U VB 照射所致光产物 CPD s 的清除存在快速期及慢速期; 川芎嗪可降低 光产物 CPD s 水平。川芎嗪的光保护作用可能与其 下调修复相关调控分子 p 53 和 PCNA 基因和蛋白 表达有关。
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收稿日期: 2006206210 基金项目: 广州新药临床前评价研究技术平台 ( 广州市重大项目, 2004Z12E4051) 作者简介: 黄 民 (1963—) , 男, 中山大学药学院院长, 教授、 博士生导师; 研究方向为药物代谢与药动学、 遗传药理学。 . sysu. edu. cn T el: (020) 87334521 Fax: (020) 87334718 E 2 m ail: huangm in@m ail 3 通讯作者 黄 民
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中草药 Ch inese Trad itiona l and Herba l D rugs 第 38 卷第 6 期 2007 年 6 月 调控基因表达的影响。 从结果中可以看出, 30 m J
2 cm U VB 辐射后, H aCaT 细胞 p 53 和 PCNA 的
中, DNA 损伤可以启动分子级联反应, 使细胞进入 细胞周期的 S 期从而为修复损伤的 DNA 提供时 间, 此系统依赖于 p 53 蛋白和 PCNA 蛋白的活化及 在细胞核内积聚, 以便参与 DNA 修复和 或细胞周 期阻滞。 继之 N ER 的内切步骤、 DNA 修复和转录 过程均需要 p 53 参与 [ 7 ]; 内切后是损伤链的外切, 最 后复制因子、 DNA 聚合酶和 DNA 连接酶相互作用 [ 3, 4 ] 完成修复 。 本实验采用免疫组织化学方法检测了 U VB 辐 射后 H aCaT 细胞自然产生和清除光产物 CPD s 的 情况, 并观察了川芎嗪对 H aCaT 细胞光产物 CPD s 的影响。 从结果可以看出, 与非照光组和阴性对照组 相比, U VB 辐射可以导致细胞 DNA 损伤而产生 CPD s, 免疫组化法可以检测到细胞核棕褐色着色的 阳性细胞。 U VB 辐射后 CPD s 产生和清除的时效作 用表现为: 照射 U VB 后细胞即开始产生 CPD s, 015 h 左右达到高峰。同时细胞也在清除 CPD s, 在开始 的 4 h 内清除速率较快, 辐射后 4 ～ 24 h, CPD s 清 除速率减慢, 表现为阳性细胞数减少不明显。 川芎中的阿魏酸能有效地抑制氧自由基产生, 保护膜脂质不被氧化, 防止 DNA 损伤发生, 还可能 抑制肿瘤细胞的增殖生长[ 6 ]。 川芎嗪为其主要的活 性成分。 本实验中在 U VB 辐射后加入川芎嗪与细 胞共同孵育后阳性细胞数明显少于单纯照射组, 证 实了川芎嗪的光保护作用在于加药可以降低细胞培 养体系中 CPD s 的量, 此效应可能与加速照光后已 生成的 CPD s 的清除有关, 进一推测可能与前述的 抗炎、 抗过氧化等机制有关。 通过 R T 2PCR 法和 W estern b lo t t ing 法比较 了单纯 U VB 辐射 H aCaT 细胞中 p 53 和 PCNA 的