最新T细胞表型及脾细胞分离

细胞计数：
步骤：①用乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻 轻拭干；②用微量移液器取少许细胞悬液（10μl），将细胞 样本从室的一个口注入，液体在室中扩散，空气从另一个 口排除；③观察计数板四角大方格中的细胞数，并计算细 胞浓度。 注意事项：①计数前，应充分混匀细胞；②对于分布在刻 线上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进 行计数；③计数时，如发现各中方格的红细胞数目相差20 个以上，表示细胞分布不均匀，必须重新计数。
2、细胞活力观察及计数
收集分离出的脾细胞，置于10ml离心管内加入培养液吹打， 取10μl细胞，与10μl胎盘蓝染液混匀后染色并观察细胞活力， 同时进行细胞计数。 细胞活力观察（台盼蓝染色）：细胞损伤或死亡时，台盼 蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，被染成淡蓝 色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，可以鉴别死细胞与 活细胞。 细胞计数：采用细胞计数板。
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实验二 小鼠脾细胞分离与制备技术
分离小鼠脾细胞，细胞计数板进行细胞计数，胎盘 蓝染色进行细胞活性检测。
实验材料：
实验动物：小鼠。 细胞培养液。 试管，滴管，离心机，培养皿， 100目细胞筛等。
1、分离小鼠脾细胞
选择小鼠，拉脱颈椎处死，用碘酒、酒精消毒皮毛。剪开皮肤， 打开腹腔。找到红色的脾脏，用镊子分离后摘除。 将脾脏放入盛有5-10ml培养液的平皿中轻轻漂洗，并细心剥除 脾脏周围的结缔组织。 将脾脏移入另一个盛有5-10ml培养液的平皿中，轻轻漂洗后置 于100目细胞筛中，轻轻挤压使脾细胞通过筛孔进入培养液中， 反复冲洗，以取得脾细胞悬液。
实验步骤
标本的制备：淋巴细胞悬液的制备 标本的染色： 结果的观察：
标本制备：淋巴细胞悬液的制备
（1）取肝素抗凝血5ml与5ml Hank’s液稀释混匀，每组取2ml，用 滴 管 贴 管 壁 轻 轻 叠 加 于 2ml 分 离 液 上 ， 配 平 后 1500rpm 离 心 10mins。
（2）洗涤细胞：用滴管仔细吸出位于血浆和分离液之间乳白色的 淋巴细胞，放入盛有2ml Hank’s液的试管，1500rpm离心10mins， 弃上清，将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液重复洗涤一 次，最后一次用PBS洗涤。
注意事项：
为防止试剂受到污染，加样器吸头最好为一次性使用。 分离单个核细胞中，将稀释血液加于分层液上时，务必要使之 形成良好的界面，否则影响分离结果。 孵育过程中，应将涂片置于湿盒中，操作中始终要注意保持涂 片的湿润，以确保得到完美的实验结果。 淋洗时不要直接对着细胞冲，避免细胞脱落。 淋洗后，加试剂前须擦干细胞圈外水分，以免试剂流散。
台盼蓝染色
材料： 4%台盼蓝母液（称取4g台盼蓝，加蒸馏水研磨，加双 蒸水至100ml，用滤纸过滤，4℃保存。使用时，用PBS稀释至 0.4%）、 血细胞计数板、显微镜等。 步骤：①制备单细胞悬液；②染色：取10μl细胞悬液与10μl台 盼蓝溶液并混匀；③计数：在三分钟内，用计数板分别计数活 细胞和死细胞。 注意事项：台盼蓝对人体有毒，尽量避免直接接触。染色时间 不宜过长，否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。
T细胞表型及脾细胞分离
T淋巴细胞表面标志
T细胞共有标志：CD3+为总细胞 T细胞特有标志：CD4+细胞为辅助细胞，
CD8+细胞为杀伤细胞。
正常值：
正常人外周血中： CD3为60% ～80%；CD4为35% ～55%；CD8为20% ～30% CD4/CD8的正常值约1.4～2.0。 CD4／CD8＜1.4： ①免疫缺陷病，如艾滋病的比值常小于0.5； ②恶性肿瘤； ③再生障碍性贫血； ④某些病毒感染。 CD4／CD8＞2.0：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。
实验报告
T细胞表型测定、小鼠脾细胞分离技术 原理、步骤及结果分析。
（3）弃去上清，淋巴细胞沉淀用200μlPBS溶解，取20μl细胞涂片， 下一次实验检测T细胞亚群用。
标本染色
细胞涂片用记号笔划圈，滴固定液1滴，室温固定2～3分钟。 滴加鼠抗人CD3、CD4、CD8抗体15μL，轻轻摇晃，使单抗均 匀铺在细胞表面，37℃孵育2～3h，PBS洗3次。 滴加生物素标记羊抗小鼠抗体15μL ，37℃孵育30～45分钟， PBS洗3次。 滴加SABC 15μL ，37℃孵育30～45分钟，PBS洗3次。 滴加显色剂30～50μL ，室温显色20～40分钟。可在显微镜下 观察，待细胞膜上出现红色标记物时，用PBS淋洗。 滴加细胞核复染液1滴，30秒后自来水淋洗。 显微镜下观察结果。
实验基本流程
二抗
T cell
一抗 待测T细胞 CD分子（？？？）
底物
实验材料
肝素、淋巴细胞分层液、Hank’s液、PBS等； 一次性注射器、试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显 微镜，温箱等。 鼠抗人CD3、CD4、CD8 单克隆抗体（1抗）；羊抗鼠IgG（生 物素化2抗）；SABC-AP；底物（BCIP/NBT 磷酸甲苯胺蓝盐） 等。
T淋巴细胞表面标志的检测，有助于了解机体的细胞免疫功能， 对免疫缺陷病、肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、移植排斥 反应等疾病的诊断、分型、预后和疗效观察有着重要的意义。
SABC-AP法测定T细胞亚群
SABC：为链酶亲和素－生物素，AP为碱性磷酸酶。 链酶亲和素：是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子结合。亲和素 与生物素一经结合就极为稳定，形成一种类似晶格的复合体。
注意事项：
以上操作中，37℃孵育时应将玻片置于湿盒中，切勿干片， 特别是加底物后，干片将导致阴阳性结果不能分辨。 观察结果时应使涂片保持湿润。
观察结果
高倍镜下计数100～200个单个核细胞。计算阳性率。 阳性细胞：细胞表面呈红色。 ①标准阳性：细胞表面呈红色，可见深蓝色细胞核； ②强阳性：细胞周缘及中央均呈红色，看不见细胞核； ③弱阳性：细胞表面呈淡红色，可见淡兰色细胞核； ④阴性细胞：细胞表面无着色反应，呈淡兰色。