蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析

Western Blot 流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取
Western Blot
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法
胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防
止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不
均匀 两块玻璃板底部要对齐
Western Blot
SDS-PAGE电泳
条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”
条带？
凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓
转移膜的选择
Western Blot
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸 纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟 乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜， 此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白 印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于 核酸杂交。
Western Blot
聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：
• 单体：丙烯酰胺（Acr）； • 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； • 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； • 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； • 产物：三维网状结构凝胶
• 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals) 的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来 完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化 （核黄素——TMTED）体系。
Western Blot
不连续电泳：
作用
浓缩胶 使蛋白样品浓缩
分离胶 使蛋白样品分离
缓冲液PH
pH6.8TrisCl
pH8.8TrisCl
凝胶浓度
低，2-5%
高，根据蛋 白大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
灌制分离胶
Western Blot
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离， 适用于任何化学发光底物系统。
酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位 点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任 何化学发光底物系统。
Western Blot
Western Blot结果分析
目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正 误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对 含量。
荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。
Western Blot
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的 样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可 以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级 和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫 键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链 形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电 荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。
Western Blot
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：http://bbs.bbioo.com/thread-20726-1-1.html
拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲
样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度
胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
Western Blot
转膜及抗体检测
凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？
1M Tris-HCl(pH6.8)
1M DTT SDS
甘油 溴酚蓝 总体积
10 ml
20 ml 4g
20 ml 0.2 g 100ml
DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。
按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～ 50μg。
蛋白质-SDS胶束的特点：
（1）具有相同的形状，形状 像一个长椭圆棒 （2）平均1g 蛋白质结合 1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分 子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取， 包括乙醇、丙酮和丁醇等。
通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
Western Blot
蛋白样品的定量
目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
响抗体与抗原的结合。
Western Blot
一抗、二抗孵育
把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中பைடு நூலகம்根据膜面积以 0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室 温孵育1-2小时或4℃过夜。
回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温
转膜缓冲液过热？
可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液 中浸泡5-10min
电转仪长期使用导致海绵变薄，“三 明治”结构不紧凑导致。可在两块海 绵之间垫上少许普通的草纸
确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压
太高。转膜过程注意降温
Western Blot
转移到膜上的蛋白很少
Western Blot
凝胶成分
丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液
Western Blot
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。
杂交信号很弱
原 1. 抗体保因存不当
2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗过度
1. 抗体长期保存应在－70℃
，使用前做效价检测
对 2. 增加蛋白上样量，做已知
策
标准量蛋白的对照
3. 减少漂洗的时间和次数
蛋白质浓度测定的各种方法汇总：
http://bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.html
Western Blot
蛋白样品的变性
2×SDS-PAGE上样缓冲液：
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O
背景太高
原 1. 膜没有因均匀浸湿
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿
2. 膜或者缓冲液污染
2. 拿取膜与吸水纸时要戴手
3. 封闭不充分
对
套，更换新鲜转膜缓冲液
4. 抗体与封闭剂出现交 策 3. 检测一抗、二抗与封闭剂
叉反应
是否有交叉反应
5. 抗体浓度过高
4. 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
Western Blot
各种膜的详细特点介绍：
http://www.bbioo.com/bio101/2008/21461_2.htm
湿转系统
Western Blot
Western Blot
半干转移系统
Western Blot
转膜后检测（此步可以省略）
丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。
Western Blot
SDS：
阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电
荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线
性化。
Western Blot
印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。
Western Blot
封闭
为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜 发生非特异性结合，使非特异性背景提高， 需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。
5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影
Western Blot 基本原理
Western Blot
Western Blot
Western Blot 优点 高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng中等大小的靶蛋白
Western Blot
Western Blot应用 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析
蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析
张绍进
Western Blot
Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析
Western Blot
Western Blot 简介：
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。
二抗与底物反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP） •碱性磷酸酶法（AP） •化学发光显色法(HRP)
Western Blot
Western Blot
膜解吸方法（膜的重复利用）
原
1. 蛋白因分子量< 10KD
2. 蛋白的等电点< 9
对
3. SDS浓度不合适
策
4. 凝胶太厚
1. 蛋白分子量<10KD时，减 少转膜时间；使用小孔径 的膜
2. 更换高pH值Buffer 3. 在阴极buffer中加入
0.005 - 0.01% SDS 可提 高转膜效率 4. 延长转膜时间
Western Blot
灌制积层胶
Western Blot
插入梳子
Staking gel Separating gel
Western Blot
Western Blot
转膜
要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。
Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）
http://bbs.bbioo.com/thread-44929-1-1.html
Western Blot
Western Blot常见问题分析
Western Blot
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析， 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。