病毒培养技术

（二）禽胚接种途径与收获 • 绒毛尿囊膜接种法
• 尿囊腔接种法 • 卵黄囊接种法 • 羊膜腔接种法 • 静脉接种法 • 脑内接种法
鸡胚绒毛尿囊膜接种法
Байду номын сангаас囊腔接种法
尿囊液收获方法
鸡胚卵黄囊接种法
（三）影响禽胚增殖病毒的因素
1．种蛋质量 ．
①病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、 支原体及传染性贫血因子等。 ②母源抗体： ③抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体
三、细胞增殖病毒技术
1．细胞培养的概念 ．
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物 组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。
细胞分类： 细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 • 原代细胞(primary cell) • 细胞株(cell strain) • 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)
中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) 中空纤维细胞培养
•组成 中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵 组成:中空纤维生物反应器 培养基容器、 组成 中空纤维生物反应器、 •中空纤维由乙酸纤维 、 聚氯乙烯 － 丙烯复合物或多聚碳酸硅 中空纤维由乙酸纤维、 聚氯乙烯－ 中空纤维由乙酸纤维 等材料制成， 外径50~100µm， 壁厚 等材料制成 ， 外径 ， 壁厚25~75µm， 壁呈海绵状 ， ， 壁呈海绵状， 上面有很多微孔。 上面有很多微孔。 •中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜 ， 允许营养物质 中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜， 中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜 和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体） 和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有 滞留作用。 滞留作用。 •培养液能有效地分布 ， 细胞培养维持时间可达数月 ， 保持高 培养液能有效地分布， 细胞培养维持时间可达数月， 培养液能有效地分布 度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度 度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高， 可达60％ 可达 ％～90％；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。 ％ 占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。
疫苗制造工艺流程
病毒性细胞疫苗制造工艺流程
病毒性组织疫苗制造工艺流程
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
寄生虫疫苗制备的工艺流程
2．细胞培养方法 ．
• 静置培养
• 转瓶培养 •悬浮培养 •悬浮培养(suspension cell culture ) 悬浮培养(suspension •微载体培养 微载体培养(microcarrier cell culture) 微载体培养 • 中空纤维细胞培养 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) • 微囊化细胞培养
悬浮培养 通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。 微载体培养 微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。 微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动化装置。细 胞产量达106～107个/m1，每升培养液可加微载体2～5g，每 克有8000～9000个珠子，培养面积约为2～5万cm2，比常规 培养面积大10～25倍。
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细胞接种量
细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少， 细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少， 这些物质分泌量少，而作用也小。 这些物质分泌量少，而作用也小。 接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快， 接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多 对细胞生长也不利。 对细胞生长也不利。 鸡胚成纤维细胞为100万／m1 万 鸡胚成纤维细胞为 小鼠或地鼠肾细胞为50万 小鼠或地鼠肾细胞为 万／m1 猴肾细胞量为30万 猴肾细胞量为 万／ml 传代细胞为10～ 万 传代细胞为 ～30万／m1
6. 病毒增殖指标与收获
细胞病变(CPE)： ： 细胞病变 ①细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等； ②细胞聚合，如腺病毒； ③细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒； ④轻微病变，如正粘病毒、冠状病毒等。 包涵体和血凝性： 包涵体和血凝性：也可作为检查病毒增殖的指标。 有些病毒不产生CPE。 病毒收获：CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放， 病毒收获 然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。 病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA 病毒毒价
2．孵化技术 ．
①温度：37～39.5℃。传染性支气管炎病毒37℃ ②湿度：鸡胚53％～57％，水禽胚比鸡胚高5％～10％。 ③通风：氧气，二氧化碳。 ④翻蛋：
3．接种技术 ．
不同病毒的增殖有不同的接种途径， 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。 •接种日龄：鸡胚13～14日龄。鸭胚15～16日龄，尿囊液含 量最高，平均约6～8ml，羊水约1～2ml。 •接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育 •严格防止禽胚污染 ①鸡胚接种时严格无菌操作； ②定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜； ③种蛋入孵前先用温水清洗，消毒，凉干。
4．细胞培养污染问题 ．
(1) 细菌污染 (2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。 真菌污染：念珠菌或酵母菌。 培养液中可见黄白色小点状悬浮物 镜检时可见菌丝结构。 镜检时可见菌丝结构。 (3) 支原体污染：污染率为 ％～60％ 支原体污染：污染率为50％ ％ (4) 病毒污染 ①组织带毒 ②培养液带毒
病毒增殖技术
动物增殖病毒技术 禽胚增殖病毒技术 细胞增殖病毒技术
一、动物增殖病毒技术
选择动物的标准： 选择动物的标准：
①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、 青壮年和健康(经临床检查、检疫)； ②对相应病毒易感，并十分敏感； ③经隔离饲养和观察检查证明健康； ④家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标 准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确， 并符合普通级实验动物标准； ⑤体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。
3. 细胞培养要素
•培养液 培养液 •血清 血清 •细胞接种量 •细胞接种量 •pH •温度 温度 •无菌条件 无菌条件 •培养器皿清洁度 培养器皿清洁度
RPMI-1640、199、 DMEM、F12
血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。 珠蛋 成分 ： 必需氨基酸 、 促进细胞生长和贴壁的成分。 α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白 能促进细胞贴壁。 球蛋白和β 能促进细胞贴壁。 球蛋白和 脂蛋白G2能促进细胞贴壁 血清选择：同种动物优于异种动物血清； 血清选择 ：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于 马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。 马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。 血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56℃灭活 血清使用： 目前国内多用犊牛血清， 使用前须经 ℃ 30min， 并进行细胞毒性试验 。 生长液血清含量一般为 ， 并进行细胞毒性试验。 生长液血清含量一般为5 ％～20％。维持液中血清量为 ～5％。 ％ 维持液中血清量为0%～ ％ 血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、 血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、 上皮生长因 结合蛋白（如转铁蛋白） 贴壁因子（如鱼精蛋白、 子）、结合蛋白（ 如转铁蛋白）、贴壁因子（ 如鱼精蛋白、 聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血清 聚赖氨酸） 和微量元素（ 如硒） 四类几十种， 培养液须补加3～ 种血清替代因子 种血清替代因子。 培养液须补加 ～8种血清替代因子。
5. 细胞培养病毒要素
维持液内犊牛血清含量一般不超过2％ （1）血清 ：维持液内犊牛血清含量一般不超过 ％。 ） （2）温度：狂犬病病毒32℃，犬疱疹病毒36℃。 ）温度：狂犬病病毒 ℃ 犬疱疹病毒 ℃ （3）pH： ） ： （4）病毒接种剂量：应以 ）病毒接种剂量：应以TCID50为依据 一般按维持液的1％ 量接入。 一般按维持液的 ％～10％(V／V)量接入。 ％ ／ 量接入 接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价； 接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价； 接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。 接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。 病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。
二、禽胚增殖病毒技术
（一）禽胚的选择 • SPF鸡胚 鸡胚 据国家标准， 据国家标准，无22种特定病原体 种特定病原体 • 非免疫鸡胚 应无特定病原的母源抗体， 应无特定病原的母源抗体， • 普通鸡胚 可能带有鸡的多种病原体， 可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产 异源性性疫苗： 异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚
（1）原代细胞 ）原代细胞(primary cell) 指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞， 细胞。 指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。 细胞 （2）细胞株 ）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞 指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目， 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系 ）传代细胞（ ） 细胞系(cell line) 能在体外无限传代， 应用方便， 能在体外无限传代 ， 应用方便 ， 其染色体数目及增殖特性 均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞， 均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系 细胞系