植物叶绿体DNA的提取
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实验1 植物叶绿体DNA的提取、PCR扩增与电泳观察
【实验目的】
1、学习从新鲜的绿色叶片中提取叶绿体DNA的方法
2、学习和掌握琼脂糖凝胶电泳观察DNA的操作方法
3、学习和掌握PCR实验的原理和操作方法
【实验原理】
叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器,具有相对独立的遗传物质——叶绿体基因组DNA(ctDNA),大小在120~160 kb,其DNA分子都是以共价、闭合、环状双链形式存在。由于cpDNA相对保守及其重要功能,已被广泛用于细胞质遗传、植物的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等多方面的研究,而获得纯度高、产量好的、结构完整的ctDNA是开展相关研究的前提条件。然而ctDNA的提取是限制深入研究的重要因素,传统的提取方法包括梯度离心提取ctDNA的方法,对设备要求高,成本高,耗时长.产率低。因此,我们要尽可能快速、简便地获得质纯、量大的ctDNA.一般来说获得纯度高、浓度大的叶绿体DNA很难,主要是因为叶绿体DNA含量太少同时在提取中有诸多因素干扰(如:核DNA、RNA、蛋白质等)。本实验通过改进部分传统操作,提取叶绿体基因组DNA,同时利用琼脂糖凝胶电泳及PCR实验检验提取效果。
【实验仪器与试剂】
1、器材:
剪刀、烧杯、移液器、枪头、量筒、匀浆器、纱布、300目尼龙网、注射器、离心管、滤膜
2、试剂:
①酶液:1%纤维素酶、0.6mM蔗糖、8mM CaCl2·2H2O、10mM NaH2PO4·2H2O,pH5.6
②洗涤液:0.6mM蔗糖、8mM CaCl2·2H2O、2mM NaH2PO4·2H2O,pH5.6
③10%SDS
④溶液A:25mM EDTA,50mM Tris,pH=8.0
⑤Tris饱和酚,氯仿,异丙醇,TE,琼脂糖,gold view,Loading buffer,DNA marker
⑥新鲜叶片
⑦ PCR Buffer、Mg2+、dNTP、上、下游引物、ddH2O、Taq DNA聚合酶
【实验步骤】
一、叶片采集
采集适量新鲜绿叶(约10g)
二、细胞破碎
首先利用剪刀将叶片剪碎,然后放于匀浆器中,先加入不含酶的酶液进行匀浆,弃渣,
将液体转移至烧杯中,加入纤维素酶至终浓度为1%后搅拌均匀,50度水浴约30分钟。
三、叶绿体分离
将经酶液处理的液体取出,依次用纱布和300目尼龙网与大注射器过滤,取滤液。
1、用电组:将上述滤液转移至50mL离心管中,3000rpm离心3分钟,弃上清。用10mL
洗涤液重悬洗涤后3000rpm离心3分钟,弃上清,洗涤两次后,即分离得到叶绿体。
2、不用电组:利用大注射器及0.2μm滤膜过滤上述滤液后,将滤膜上的叶绿体刮下,
转移至1.5mL离心管中,即分离得到叶绿体。
四、DNA提取
1、用电组:
①向叶绿体中加入500μL溶液A把叶绿体悬浮,转移至1.5mL离心管中。
②加入200μL10%SDS(裂解叶绿体膜,释放DNA),混匀后静置2min;
③加入350μL苯酚(使蛋白质变性)+350μL氯仿(与苯酚互溶,易于除去苯酚),混匀,
10000rpm离心2min;
④转移上层液体至新的离心管中,加入等体积氯仿(去除苯酚),混匀,10000rpm离心2min;
⑤转移上层液体至新的离心管中,加入0.6倍体积异丙醇(沉淀DNA)沉淀10min;
⑥10000rpm离心5min,弃上清;
⑦加入500μL70%乙醇(去除盐离子)洗涤沉淀,10000rpm离心5min,晾干;
⑧30μL TE溶解DNA;
2、不用电组:
①向叶绿体中加入500μL溶液A把叶绿体悬浮;
②加入200μL10%SDS,混匀后静置2min;
③加入适量KI固体至饱和后静置至出现明显分层;
④将下层透明液体转移至DNA吸附柱中,用洗耳球将液体吹出,DNA吸附于硅胶膜上,弃
液体;
⑤向吸附柱中加入500μL70%乙醇,用洗耳球吹出,弃液体,晾干;
⑥将吸附柱至于新的1.5mL离心管中,用30μL TE溶解DNA,用洗耳球将液体吹入离心
管中。
五、PCR扩增特征条带
25μL体系:
PCR Buffer 2.5μL
Mg2+ 1.5μL
dNTP 2.0μL
上、下游引物各2.5μL 加至PCR管中
ddH2O 8.0μL
Taq DNA聚合酶 1.0μL
DNA模板 5.0μL
PCR结束后,取5 μL在 O.8%的琼脂糖上电泳,观察。
六、叶绿体DNA的电泳观察
取提取的叶绿体DNA 5 μL在 O.8%的琼脂糖上电泳,电泳1h后,使用自制的LED 灯进行观察。
【实验结果与讨论】
1、为保证叶绿体DNA的含量和纯度,在本实验操作中,样品前处理、抽提、纯化等操作中应注意什么?
2、提取不同种植物的叶绿体DNA,比较、分析实验结果。