单色荧光标记表达谱芯片

单色荧光标记表达谱芯片

实验流程

一、准备One-Color Spike Mix【根据上样量选择稀释步骤】

1、将One-Color Spike Mix stock solution在vortex上混匀，37度处理5分钟，在vortex

上混匀，然后瞬时离心。

2、第一次稀释：在第一个管子上标注第一次稀释spike-in，在vortex上混匀spike mix，

37度循环水浴中加热5分钟，vortex再次混匀，瞬时离心。在管子中加入2 ul的

spike mix。再加入38 ul Dilution Buffer，vortex混匀，瞬时离心。

3、第二次稀释：在第二个管子上标注第二次稀释spike-in，加入第一次稀释液2 ul，

再加入48 ul Dilution Buffer，vortex混匀，瞬时离心。

4、第三次稀释：在第三个管子上标注第三次稀释spike-in，加入第二次稀释液2 ul，

再加入38 ul Dilution Buffer，vortex混匀，瞬时离心。

5、第四次稀释：在第四个管子上标注第四次稀释spike-in，加入第三次稀释液10 ul，

再加入30 ul Dilution Buffer，vortex混匀，瞬时离心。

保存：Store the Agilent RNA Spike- In Kit, One- Color at –70°C to –80°C in a non- defrosting freezer for up to 1 year from the date of receipt. The first dilution of the Agilent One- Color Spike Mix positive controls can be stored up to 2 months in a non- defrosting freezer at - 70°C to - 80°C and freeze/thawed up to eight times.

二、探针标记

1、将25-200 ng 总RNA加入1.5 ml离心管中终体积1.5 ul。【RNA保存要浓度大于

100ng/ul，使用时再稀释】

2、每个管里加入2 ul稀释后的spike mix，终体积3.5 ul。

3、按照下表配制

4、每个管中加入1.8 ul T7 Promoter Primer Mix，终体积5.3 ul。

5、65度水浴中10分钟，使引物和RNA变性。

6、冰上放置5分钟。

7、将5X first strand buffer于80度预热3-4分钟。Vortex混匀，然后瞬时离心。室温

放置待用。

8、

9、按照上表配制cDNA Master Mix。

10、瞬时离心每个反应管，每管中加入4.7 ul cDNA Master Mix，用枪混匀，终体

积10 ul。

11、将反应管在40度水浴中，放置2小时。

12、然后转入70度水浴中，放置15分钟。

13、然后冰上放置5分钟，瞬时离心。

保存：如果想在此暂停实验，可以放置于-80度保存。

14、按照下表配制Transcription Master Mix

15、每反应管加入6 ul Transcription Master Mix，用枪混匀，终体积16 ul。

16、然后在40度水浴中处理2小时。

保存：如果想在此暂停实验，可以放置于-80度保存。

三、纯化探针【0.5h】

1、加84 ul nuclease-free water到cRNA【标记后的探针】中，总体积100 ul。

2、加入350 ul buffer RLT 然后用枪混匀。

3、加入250 ul （96%-100%）乙醇，用枪混匀【此处不离心】。

4、将总共700 ul体系转入RNeasy mini column中，13000 rpm，4度离心30秒，弃

滤过液。

5、将RNeasy mini column转入新的收集管中，加500 ul RPE，13000 rpm，4度离心

30秒，弃滤过液。

6、再加500 ul RPE到RNeasy mini column，13000 rpm，4度离心60秒，弃滤过液

和收集管。

7、将RNeasy mini column转入新的收集管中，加入30 ul RNase-free water，等60秒

后，13000 rpm，4度离心30秒。冰上放置滤过液。

8、测定标记效率

四、芯片杂交

1、按如下比例配杂交体系

2、60度处理30min，使cRNA片段化，然后迅速冰上处理1 min。【不要再这一步停

留超过30min。冰上放置或加入2×hybridization buffer均可以终止fragmentation 过程】

3、按下表加入合适体积的2×GEx Hybridization Buffer HI-RPM【目的：终止片段化

过程】

4、用枪混匀【不要用vortex】，一定避免产生气泡。

5、13000 rpm 室温离心1 min。

6、冰上放置，迅速将杂交液加到芯片上。

7、缓慢将杂交液加入gasket小室中。

8、将芯片agilent活性面朝下放到gasket上，夹紧chamber。

9、65度，10 rpm 杂交17小时。

五、芯片洗涤

1、总体步骤如下

2、按照商标准备好洗缸，洗缸1和2中加入室温的Wash Buffer 1，洗缸3中加入37

度预热的Wash Buffer 2.

3、在洗缸1中打开gasket与microarray，将芯片放入洗缸2中。

4、在洗缸2，中速洗涤1min。

5、然后迅速转入洗缸3中，中速洗涤1min。

6、然后从洗缸3中缓慢拿出芯片。

7、进行芯片扫描。

六、芯片扫描和数据提取

1、程老师实验室的扫描仪为Agilent Scanner B。

2、按照如下设定扫描参数