外源蛋白表达系统及利用植物表达外源蛋白的特点与优势_王瑞刚

外源蛋白表达系统及利用植物表达外源蛋白的特点与优势

王瑞刚1,2　王水平1

(1华东师范大学生命科学学院上海200062)

(2内蒙古农业大学农学院呼和浩特010018)

摘要　比较了大肠杆菌、酵母、昆虫细胞/杆状病毒、哺乳动物细胞、动物乳腺以及植物等不同受体作为外源蛋白表达系统的优缺点,论述了植物外源蛋白表达系统的特点,阐明利用植物生产外源蛋白的潜在优势。

关键词　外源蛋白表达系统　植物　生物反应器

通过基因重组技术利用生物体表达、生产外源蛋白是当前生物技术研究与开发的热点之一,这一技术被称之为生物反应器(Bior eactor)工程。微生物、植物和动物均可用作外源蛋白的受体系统,但不同的受体系统存在各异的表达特性。因此,选择外源蛋白高效表达系统是非常重要的。

本文通过对大肠杆菌、酵母、昆虫细胞/杆状病毒、哺乳动物细胞、动物乳腺以及植物等几种常用外源蛋白受体表达系统的特点及优劣性比较,试图阐明植物外源蛋白表达系统的特点及潜在优势。

1　植物以外的外源蛋白表达系统及其局限性

目前,利用基因重组技术生产外源蛋白主要是以大肠杆菌为代表的原核生物,以及以酵母、昆虫、哺乳动物细胞、哺乳动物乳腺和植物等为代表的真核生物。由于目的蛋白的分子结构各异,其表达产物的产率和活性受可溶性、稳定性、分子量大小等诸多因素的制约,因此,不同的表达系统都存在其本身所固有的优势和局限性。

1.1　大肠杆菌表达系统　大肠杆菌表达系统可以表达产生大量蛋白,便于在短期内纯化、分析和使用这些表达蛋白;另外,其基因导入方便,生产成本较低。但其表达产物容易形成包涵体,纯化步骤繁杂,从而大大提高了其生产成本;同时由于大肠杆菌表达系统属于原核生物表达系统,不能进行糖基化、正确折叠等蛋白翻译后加工步骤,使许多真核基因无法利用该系统生产;而且,利用大肠杆菌表达系统生产的重组医用、食用蛋白,其热源性物质难以去除,人服用后易引起发烧等毒副反应。另外,该系统的投入较大,发酵设备昂贵也是其重要的限制因子之一。

1.2　酵母表达系统　酵母表达系统具有大肠杆菌表达系统的种种优点。同时,由于酵母属于真核生物,具有高等生物糖基化合成途径的早期过程,能够表达部分糖蛋白,且这些表达产物可以分泌型表达,利于工业化规模生产。另外,在大肠杆菌表达系统表达为包涵体的某些抗体在酵母表达系统中可表达为可溶性分子,而在大肠杆菌中易降解的部分外源蛋白,也可以通过其在酵母体内的表达而得以缓解。

尽管如此,由于酵母细胞具有转移高甘露糖功能,造成其糖蛋白产物具有较强的抗原性并容易在血液循环中被降解;另外,酵母表达系统所表达的糖蛋白产物与天然产物在结构上也存在较大差异,从而大大限制了其应用范围。

1.3　昆虫细胞/杆状病毒表达系统　昆虫细胞/杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统都可以成功的表达多种真核基因,产物构象与天然产物接近,表达量较高,且可进行磷酸化、酰化等其他翻译后修饰,其糖基化位点与哺乳动物细胞相同,只是在寡糖链长短上存在某些差异。虽然昆虫细胞能准确处理来自哺乳动物细胞的信号肽,但其不能或只能部分识别其他的水解位点。另外,由于该系统成本很高,且其需特殊的培养基和培养设备,分离纯化步骤较为繁杂,同时受生物量小、培养周期长等限制,难以进行大规模生产。

1.4　哺乳动物细胞表达系统　虽然哺乳动物细胞表达系统在表达真核蛋白时,在蛋白合成起始信号、加工、分泌和糖基化等方面具有独特优势。但它同时具有昆虫细胞/杆状病毒表达系统的大部分缺点,而且如何提高细胞密度也是其难以解决的重要限制因子。

1.5　转基因动物乳腺反应器　利用动物乳腺生产重组蛋白是当前的研究开发热点之一。由于其表达体系简单,具连续性,可正确的进行翻译后修饰加工,同时其饲养费用低廉,对环境没有污染,因此受到人们的普遍关注。而其对表达的基因具有较高的选择性,从实际考虑,其表达的外源蛋白仅限于食用及医用,对工业、环境用蛋白是无能为力的,且其还受前期投入较大、周期较长的限制。

2　植物作为外源蛋白表达系统的优势及特点过去,仅限于利用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞/杆状病毒、哺乳动物细胞以及动物乳腺生产外源药用、工业用以及环境和食品用蛋白。但由于植物能够表达来自动物、人类、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质,易于大

规模的培养和生产,且在基因表达与修饰及安全性方面有其特别的优势,因此,利用植物生产外源蛋白的研究展现了极其诱人的前景。

2.1　植物表达系统具有高产及廉价潜力　人类有悠久的植物栽培史,在栽培、繁育、开发植物资源方面已形成较为完备的理论与技术体系。目前,可以按照人们的意愿定向的对植物进行改良和高产栽培。因为这一系统仅需要适宜的植物及其生长条件,省却了昂贵的发酵设备及厂房投资,免去了培养基和能源等的消耗,加之已建立了高效收获、贮存及加工体系,可以实现低投入与高产出。利用大豆生产异源蛋白质时,如果其外源蛋白质产量能达到总蛋白质的1%,其生产成本大约为每克产品0.1美元。从生物量(bio mass pr oduc tion)角度看,植物的生物量较大,如一棵生长健壮的烟草可达5kg,相当于500L3发酵后的大肠杆菌的生物量;而且可以大量繁殖和田间栽培。利用植物种子表达体系一般情况下表达的基因工程产物可占种子总蛋白的1%左右,也有4%～10%的报道,而油菜、大豆种子的总蛋白占干重的40%～60%左右。由此可见,植物生产系统比其他任何系统都更为低廉有效。

2.2　植物表达系统的潜在安全性　尽管人们开发了细菌、病毒、昆虫、哺乳动物以及植物等一系列能够表达重组蛋白的系统,并在实践中进行了大量探索和应用,但人们不能不担心这些重组蛋白及其工程体对人类的潜在危险性。

当前的重组蛋白生产系统主要包括原核细胞和真核细胞两大类,这两类表达系统在重组蛋白产量、产品的可靠性和安全性等方面都各自有一些优缺点。尽管细菌表达系统产量高,但它对许多真核生物的蛋白缺乏有效的翻译后加工,细菌本身是人类的病原体,它生产的蛋白必须经过严格的纯化才能应用。虽然动物细胞表达系统的应用可以解决生物活性问题,但动物培养细胞可能污染的动物病毒对人类健康也可能造成潜在危害。与此不同,植物是人类的主要食品来源,植物中的寄生微生物或植物病毒不感染人类,对于工程植物体可以通过栽培、育种等途径对其生长释放及产物进行控制,因此,植物生产系统是较为安全的生产系统。

2.3　植物具有外源蛋白加工及修饰能力　植物细胞具有与动物细胞相似的结构和功能,有利于重组蛋白的正确装配和表达。植物作为高等真核生物,尤其适用于表达具有复杂翻译后加工过程的异源蛋白,如糖蛋白类活性药物,能使表达产物具有与高等动物细胞的表达产物相一致或接近的免疫原性和生物学活性。将鼠的单克隆抗体的K链、杂合的Ig A-G抗体重链、鼠的J链和兔的SC转基因烟草株系进行有性杂交和子代重组,可以得到同时表达4个蛋白链的转基因植株,其重组蛋白可自然装配成有功能的分泌型免疫球蛋白,这说明植物组织对外源蛋白有良好的加工和修饰能力。

2.4　植物外源蛋白表达系统的灵活性与实用性　与其他外源蛋白表达系统不同,植物外源蛋白表达系统有更好的灵活性和实用性。首先,可利用组织特异性调控序列将外源蛋白定位到特定的亚细胞结构或植物组织,从而简化蛋白产物的加工程序,如口服疫苗;其次可通过诱导性调控元件与发育特异性调控序列使外源蛋白在特定的生长阶段表达,减少外源产物对植物的伤害及消耗。最后,还可以通过分泌性信号序列将外源蛋白产物分泌出植物体,如利用植物根系分泌表达外源蛋白,可减少外源蛋白对植物生长的影响和实现其工厂化生产。另外,通过转基因植物的杂交技术等可以实现多价转基因植物疫苗的生产。

尽管利用植物表达、生产外源蛋白起步较晚,但目前已经能够利用植物生产多种医用、食品用以及工业用蛋白及酶制剂。随着人类对科学认识的提高,会有更多的产品利用植物来表达、生产,人们对转基因植物安全性的质疑以及植物转基因存在的某些技术问题,会提高科学家对转基因植物的审慎和研究,这对于植物外源蛋白表达系统的应用与开发将是极大的动力。

参考文献

　1　Arakawa T,Langridge W HR.Plants are not just passiv e creatures.Natu re M ed,1998,4:550.

　2　Aus tin S,Bingham E T,Koegel RG et al.An overview of a feasibility study for th e p rod uction of ind ustrial enzymes in trans genic Alfalfa.Ann NY Acad Sci,1999,

234.

　3　Chong DKX,Roberts W,Arakaw a T et al.s tatem ent of th e human milk proteinα-casein in trans genic potato

plan ts.Tran sgenic Res,1997,6:289.

　4　Cramer C L,W eiss en born DL,Ois hi KK et al.

Bioproduction of h uman en zym es in trans genic

tobacco.Ann NY Acad Sci,1996,792(2):62.

　5　Arn tzen CJ.H igh-tech h erbal medicine:plant-based vaccin es.Natu re Biotech nology,1997,15:221.

　6　Brow n K.Vaccin e cuisin e.Environ men tal Health Pers pectives,1996,104(3):276.

(BH)