第9章 酶分子改造和修饰

2013年11月4日星期一Chapter 9 Modification of Enzyme Molecule

酶分子改造和修饰

总学时32学时（选修，考查，2学分） 理论：22学时

实验：10学时

成绩

•本课程总成绩评定

平时20%

实验成绩20%

期末考核60%

Contents of chapter 9

1、什么是酶分子修饰

2、酶分子修饰的基本要求和条件

3、酶分子的修饰方法

4、酶修饰后的性质变化

5、酶的定向进化

9.1 什么是酶分子修饰？

通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。

酶分子修饰的意义

•提高酶的活力activity

•增强酶的稳定性stability

•降低或消除酶的抗原性immunological property •研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响structure

9.2 酶分子修饰的基本要求和条件

对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。

（1）酶的稳定性

热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。

（2）酶活性中心的状况

活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。

酶分子修饰的条件

修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。

（1）pH与离子强度

pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。

（2）修饰反应的温度与时间

严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。

（3）反应体系中酶与修饰剂的比例

9.3 酶分子的修饰方法

•金属离子置换修饰

•大分子结合修饰（共价/非共价）•侧链基团修饰

•肽链有限水解修饰

•核苷酸链有限水解修饰

•氨基酸置换修饰

•核苷酸置换修饰

•酶分子的物理修饰

第一节酶的金属离子置换修饰

把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。

有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。

α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），

谷氨酸脱氢酶中的锌离子（Zn2+），

过氧化氢酶分子中的铁离子（Fe2+），

酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+），

超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子（Cu2+，Zn2+）

若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。

如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。

若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。

有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。

一、金属离子置换修饰的过程或方法

1. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。

2. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。

3. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得

到经过金属离子置换后的酶。

金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子

的酶。

用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。

通过金属离子置换修饰可以达到下列目的：

（1）阐明金属离子对酶催化作用的影响

（2）提高酶活力

结晶的钙型α-淀粉酶活力是杂离子型α-淀粉酶活力的三倍。

钙型蛋白酶活力是锌型蛋白酶活力的120-130%。

（3）增强酶的稳定性

Mn-SOD＞Fe-SOD

（4）改变酶的动力学特性

酰基化氨基酸水解酶的活性中心的锌离子为钴离子置

换后，最适从pH8.5降低为7.0，且K

m 增大。

二、金属离子置换修饰的作用

第二节酶的大分子修饰

采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。

非共价修饰（补充）

•使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。•一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。

•另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。

共价修饰

•用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。

•例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。

•每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；

•每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍。