美洲商陆遗传转化体系的构建
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江苏农业科学
杨
２ ０ １ ３年第 ４ １卷第 ６期
－ － — —４ ９・ － — —
杰， 杨子仪 ， 徐亚莉 ， 等．美洲商陆遗传转化体系的构建［ Ｊ ］ ．江 苏农业科学 ， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ ６ ） ： ４ ９ — ５ ２
美 洲商陆遗传转化体 系的构建
杨 杰 ，杨子 仪 ， 徐 亚 莉 ，张 源 ，郑铁松 ，陆长梅
且基 因转化位点不一定是不定芽再生位点 。因此要获得 比较
１ ． ２ ． １ 无菌苗准备 与外植体获取
取成 熟饱满 的美洲 商陆
种子 ， 用浓硫 酸处理 １ ２ ｍ ｉ ｎ后 ， 再 用无菌水 冲洗 ６—８次 ， 接
种到 ＭＳ培养基中 ， 于（ ２ ６±１ ）℃下 暗培养 ３ ｄ ， 待种子 萌发 后， 置于光强 ２ ０ ０ ０ ｋ、 光 暗周 期 １ ４ ｈ ／ ｄ下培养 。待 ２～３周 后长成约 ４ ｃ ｍ高的六 叶期无菌苗时 ， 取无菌苗节间距较 短的
（ １ ． 南京师 范大学生命科学学 院 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ ２ ３ ； ２ ． 南京师范大学金陵女子学院 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ ２ ４ ）
摘要 ： 在已构建高频再生体系 的基 础上 ， 研究构建美洲 商陆遗传转化体系 的条 件 。结果表 明 ： ２ ５ ０ ｍ ｇ ／ Ｌ头孢霉 素 既能有效抑制根癌农杆 菌的增殖 ， 且对 不定芽分化影 响相对较小 ； 美洲商陆对潮霉素高度敏感 。美洲商陆 的遗传转化 过程为 ： 无 菌苗上部经增粗培养后 ， 取茎节在不定芽分化 培养基 （ Ａ Ｂ Ｄ Ｍ） 中预培养 ５ ｄ ， 在Ｄ 为０ ． ６的菌液 中侵染 ３～ ５ ａ ｒ ｉ ｎ ， 再转接 到 Ａ Ｂ Ｄ Ｍ 中黑暗 、 ２ ６℃共培养 ３ ｄ ； 然后外植体经 冲洗 后转 接至含 ２ ５ ０ ｍ ｇ ／ Ｌ头孢霉素的 Ａ Ｂ Ｄ Ｍ 中进 行脱 菌 、 分化 以及不 定芽伸长培养 ； 待不定芽长至 ２ ｃ ｍ以上时 ， 截取 并转接 到含 ３ ｍ ｇ ／ Ｌ潮霉 素的生根培养 基 中进行
美洲商陆 （ Ｐ ｈ ｙ ｔ ｏ ｌ ａ ｃ ｃ ａ ａ ｍ ｅ ｒ ｉ ｃ ａ ｎ ａ Ｌ ｉ ｎ ｎ ． ） 为商 陆科 商陆属 多年生草本植 物。我国很早就 将美洲 商陆应用 于 医药 、 病 虫 害防治 、 食 品着色等领域 。近年来 ， 由于发现以美 洲商 陆为代
表 的商陆属植物具 有抗病 毒… 、 对 重金属 尤其是 Ｍｎ的超 富
培养基 。无菌 苗 培养 基 ： Ｍ Ｓ ； 上茎 节增 粗诱 导 培养 基
ＭＳ＋１ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ ６一Ｂ Ａ＋０ ． ２ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｎ Ａ Ａ； 不 定芽 分化培 养基
（ Ａ Ｂ Ｄ Ｍ） ： Ｍ Ｓ十 ０ ． ０ ２ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｔ Ｄ Ｚ＋ ３ ． ０ ｍ ｅ ， ／ Ｌ ６一Ｂ Ａ＋ ０ ． ０ １ ｍｇ ／ Ｌ
克隆药物基 因提供植物材 料 ； 另一方 面可为研 究美洲 商陆 的 富集机理 、 代谢 途径以及 美洲 商陆重金 属富集 相关功 能基 因
试剂 ： ６一Ｂ Ａ、 Ｎ Ａ Ａ、 Ｔ Ｄ Ｚ 、 卡那霉 素 （ Ｋ ａ ｒ １ ） 、 头 孢 霉 素
（ Ｃ ｅ ｆ ） 、 青霉素钠 （ Ｐ ． Ｇ） 、 氨苄青霉 素（ Ａ ｍ ｐ ） 、 潮霉素 （ Ｈ ｙ ｇ ） 。
氏山区。
菌株 ： 含 双 元 表 达 载 体 的根 癌 农 杆 菌 Ｅ Ｈ Ａ １ ０ ５（ Ｃ ＭＡ ． Ｂ Ｉ １ ３ ０ １一Ｇ Ｆ Ｐ ） ， 内含卡那霉 素、 潮霉 素抗性 筛选基 因和 Ｇ Ｆ Ｐ
报告基 因。
集 等作用 ， 更激发 了人们认 识和开 发利用美 洲商 陆资源 的 积极性 。但 野 生 美 洲 商 陆 具 有 生 长 周 期 较 长、 有 毒 等 特 点 ］ ， 使美洲商 陆资源没 有得到合 理开发 利用 。建 立一整套 美洲商 陆再生体 系和遗传 转化体 系 ， 一方面有 利于美 洲商陆 多种重要次生代谢产物 的工业化 生产 ， 并可从 美洲商 陆体 内
理想 的转化系统 ， 需要在 高效稳定再生体 系的基 础上 ， 研究影
响转化效率 的各种 因素 ， 如抗生 素种类与浓度 、 菌液 浓度 、 侵
染时间 、 预培养 时间、 共培养时间、 筛选 时期等 ， 找到适合外植 体遗传转化及再生的环境条件 。本研究在已构建的美洲商陆 高频再生体系基础上 ， 筛 选适合 根癌农杆 菌介导美 洲商 陆外 植体再生的环境条件 ， 旨在建立美洲商陆 的遗传转化体系 。
Ｎ Ａ Ａ； 不定 芽伸 长 培养 基 ： Ｍ Ｓ＋０ ． ０ ２ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｔ Ｄ Ｚ＋３ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ ６一 Ｂ Ａ＋０ ． ０ １ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｎ Ａ Ａ ＋２ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｇ Ａ ３ ； 生根培养 基： １ ／ ２ ＭＳ＋ ０ ． ４ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｎ Ａ Ａ； 脱 菌及生根筛选等培养基 是在相应
抗性芽筛选 ， 筛 选出的抗潮霉素植株再 经 Ｇ Ｆ Ｐ显色 、 Ｐ Ｃ Ｒ、 分 子杂交 等方法进一步阳性确认 。
关键词 ： 美洲商 陆 ； 遗传转化 体系 ； 外植体 ； 不定芽 ； 抗 生素 ； 筛选
中图分类号 ：Ｑ ９ ４ ５ ． ５ 文献标 志码 ： Ａ 文章编 号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ６— ０ ０ ４ ９— ０ ３
奠定基础 ， 并对进一步开发 利用美洲 商陆具 有重要 意义。高 效稳定 的再生体系是进行 遗传转化 的基础 和保证 ， 但 良好 的 再生体 系不一定能建立 良好 的转化体系 。这是方 法
传转化 过程 中， 外植体受到根癌 农杆菌 、 抗生素 等诸多影 响 ，
杨
２ ０ １ ３年第 ４ １卷第 ６期
－ － — —４ ９・ － — —
杰， 杨子仪 ， 徐亚莉 ， 等．美洲商陆遗传转化体系的构建［ Ｊ ］ ．江 苏农业科学 ， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ ６ ） ： ４ ９ — ５ ２
美 洲商陆遗传转化体 系的构建
杨 杰 ，杨子 仪 ， 徐 亚 莉 ，张 源 ，郑铁松 ，陆长梅
且基 因转化位点不一定是不定芽再生位点 。因此要获得 比较
１ ． ２ ． １ 无菌苗准备 与外植体获取
取成 熟饱满 的美洲 商陆
种子 ， 用浓硫 酸处理 １ ２ ｍ ｉ ｎ后 ， 再 用无菌水 冲洗 ６—８次 ， 接
种到 ＭＳ培养基中 ， 于（ ２ ６±１ ）℃下 暗培养 ３ ｄ ， 待种子 萌发 后， 置于光强 ２ ０ ０ ０ ｋ、 光 暗周 期 １ ４ ｈ ／ ｄ下培养 。待 ２～３周 后长成约 ４ ｃ ｍ高的六 叶期无菌苗时 ， 取无菌苗节间距较 短的
（ １ ． 南京师 范大学生命科学学 院 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ ２ ３ ； ２ ． 南京师范大学金陵女子学院 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ ２ ４ ）
摘要 ： 在已构建高频再生体系 的基 础上 ， 研究构建美洲 商陆遗传转化体系 的条 件 。结果表 明 ： ２ ５ ０ ｍ ｇ ／ Ｌ头孢霉 素 既能有效抑制根癌农杆 菌的增殖 ， 且对 不定芽分化影 响相对较小 ； 美洲商陆对潮霉素高度敏感 。美洲商陆 的遗传转化 过程为 ： 无 菌苗上部经增粗培养后 ， 取茎节在不定芽分化 培养基 （ Ａ Ｂ Ｄ Ｍ） 中预培养 ５ ｄ ， 在Ｄ 为０ ． ６的菌液 中侵染 ３～ ５ ａ ｒ ｉ ｎ ， 再转接 到 Ａ Ｂ Ｄ Ｍ 中黑暗 、 ２ ６℃共培养 ３ ｄ ； 然后外植体经 冲洗 后转 接至含 ２ ５ ０ ｍ ｇ ／ Ｌ头孢霉素的 Ａ Ｂ Ｄ Ｍ 中进 行脱 菌 、 分化 以及不 定芽伸长培养 ； 待不定芽长至 ２ ｃ ｍ以上时 ， 截取 并转接 到含 ３ ｍ ｇ ／ Ｌ潮霉 素的生根培养 基 中进行
美洲商陆 （ Ｐ ｈ ｙ ｔ ｏ ｌ ａ ｃ ｃ ａ ａ ｍ ｅ ｒ ｉ ｃ ａ ｎ ａ Ｌ ｉ ｎ ｎ ． ） 为商 陆科 商陆属 多年生草本植 物。我国很早就 将美洲 商陆应用 于 医药 、 病 虫 害防治 、 食 品着色等领域 。近年来 ， 由于发现以美 洲商 陆为代
表 的商陆属植物具 有抗病 毒… 、 对 重金属 尤其是 Ｍｎ的超 富
培养基 。无菌 苗 培养 基 ： Ｍ Ｓ ； 上茎 节增 粗诱 导 培养 基
ＭＳ＋１ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ ６一Ｂ Ａ＋０ ． ２ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｎ Ａ Ａ； 不 定芽 分化培 养基
（ Ａ Ｂ Ｄ Ｍ） ： Ｍ Ｓ十 ０ ． ０ ２ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｔ Ｄ Ｚ＋ ３ ． ０ ｍ ｅ ， ／ Ｌ ６一Ｂ Ａ＋ ０ ． ０ １ ｍｇ ／ Ｌ
克隆药物基 因提供植物材 料 ； 另一方 面可为研 究美洲 商陆 的 富集机理 、 代谢 途径以及 美洲 商陆重金 属富集 相关功 能基 因
试剂 ： ６一Ｂ Ａ、 Ｎ Ａ Ａ、 Ｔ Ｄ Ｚ 、 卡那霉 素 （ Ｋ ａ ｒ １ ） 、 头 孢 霉 素
（ Ｃ ｅ ｆ ） 、 青霉素钠 （ Ｐ ． Ｇ） 、 氨苄青霉 素（ Ａ ｍ ｐ ） 、 潮霉素 （ Ｈ ｙ ｇ ） 。
氏山区。
菌株 ： 含 双 元 表 达 载 体 的根 癌 农 杆 菌 Ｅ Ｈ Ａ １ ０ ５（ Ｃ ＭＡ ． Ｂ Ｉ １ ３ ０ １一Ｇ Ｆ Ｐ ） ， 内含卡那霉 素、 潮霉 素抗性 筛选基 因和 Ｇ Ｆ Ｐ
报告基 因。
集 等作用 ， 更激发 了人们认 识和开 发利用美 洲商 陆资源 的 积极性 。但 野 生 美 洲 商 陆 具 有 生 长 周 期 较 长、 有 毒 等 特 点 ］ ， 使美洲商 陆资源没 有得到合 理开发 利用 。建 立一整套 美洲商 陆再生体 系和遗传 转化体 系 ， 一方面有 利于美 洲商陆 多种重要次生代谢产物 的工业化 生产 ， 并可从 美洲商 陆体 内
理想 的转化系统 ， 需要在 高效稳定再生体 系的基 础上 ， 研究影
响转化效率 的各种 因素 ， 如抗生 素种类与浓度 、 菌液 浓度 、 侵
染时间 、 预培养 时间、 共培养时间、 筛选 时期等 ， 找到适合外植 体遗传转化及再生的环境条件 。本研究在已构建的美洲商陆 高频再生体系基础上 ， 筛 选适合 根癌农杆 菌介导美 洲商 陆外 植体再生的环境条件 ， 旨在建立美洲商陆 的遗传转化体系 。
Ｎ Ａ Ａ； 不定 芽伸 长 培养 基 ： Ｍ Ｓ＋０ ． ０ ２ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｔ Ｄ Ｚ＋３ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ ６一 Ｂ Ａ＋０ ． ０ １ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｎ Ａ Ａ ＋２ ． ０ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｇ Ａ ３ ； 生根培养 基： １ ／ ２ ＭＳ＋ ０ ． ４ ｍ ｇ ／ Ｌ Ｎ Ａ Ａ； 脱 菌及生根筛选等培养基 是在相应
抗性芽筛选 ， 筛 选出的抗潮霉素植株再 经 Ｇ Ｆ Ｐ显色 、 Ｐ Ｃ Ｒ、 分 子杂交 等方法进一步阳性确认 。
关键词 ： 美洲商 陆 ； 遗传转化 体系 ； 外植体 ； 不定芽 ； 抗 生素 ； 筛选
中图分类号 ：Ｑ ９ ４ ５ ． ５ 文献标 志码 ： Ａ 文章编 号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ６— ０ ０ ４ ９— ０ ３
奠定基础 ， 并对进一步开发 利用美洲 商陆具 有重要 意义。高 效稳定 的再生体系是进行 遗传转化 的基础 和保证 ， 但 良好 的 再生体 系不一定能建立 良好 的转化体系 。这是方 法
传转化 过程 中， 外植体受到根癌 农杆菌 、 抗生素 等诸多影 响 ，