碱性磷酸酶的提取

碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度

一、碱性磷酸酶

1、碱性磷酸酶的提取

碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。

AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术

AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。

3、碱性磷酸酶的纯度检测

酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg•pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。

在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。

二、设计实验

本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。先

用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。

用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：

(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。溶剂应预冷，加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。

(2)溶剂的pH 值最好控制在被分离物质的等电点附近，以提高被分离物质的分离效果。蛋白质浓度应控制在5-20 mg/m1，以防止高浓度样品的共沉淀作用。

(3)溶液的离子强度控制在0.05一0.1范围内。

(4)有机溶剂中有中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离效果。中性盐浓度一般0.05mo1/L 左右为好，过高影响沉淀。