家族性高胆固醇血症黄色瘤的家系遗传分析

ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ｔｍ］ｅｈ—ｄｏｗｎ ｉ＇ＣＲ ａｎ（】雌４Ｈ＇ｓ。ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｍｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｈｅ １．ｅ—
ｓｕｈｓ ｗｆ，Ｈ－ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｏＩｍａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｔｏ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ
合子患者及其寡系成员ｌ，Ｉ）１，Ｈ基蚓启动于和伞部１８个外显广片段，结果与ＧｅｎＢａｎｋ公布的该基凼正常序列对比找
…突变．吲ｕ寸榆测载脂蛋门Ｂ。（ｕｐｏＢ。，）幕Ｈ Ｑ３５００Ｒ突变，以排除家族性ａｐｏＢ．。缺陷症。结果：该患者ＬＤＬＲ蛙Ｈ第 １２外届ｆ的第１ ７４７位和ｌ ７７３位碱基发生替换．前者导致１１５８３Ｙ突变，而后者束发现氮硅酸改变。同日ｊ未检删卅
结
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清巾ＴＣ、＝酰甘｝１１ｔ（ＴＧ）；磷钨酸镁沉淀及酶法测定 高密度脂蛋白一肌固醇（ＨＤＬ—Ｃ１；免疫沉淀法测定载 脂蛋白（ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ，ａｐｏＢ）、载脂蛋白Ａ（ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ，ａｐｏＡ）。
一、先证者及其１２名家族成员血脂测定 血脂测定发现先证者及７名家属成员ＴＣ和 ＨＤＬ—Ｃ均升高，其余正常，结果见表２。根据血脂检 测结果绘制家系图ｆ见图３）。
表１ ＬＤＬＲ和ａｐｏＢｌ００基因Ｑ３５００Ｒ位点外显子引物序列（共２１对引物）
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５‘端引物序列 ＧＪＧ（；＾ＧＧＧ｜＇Ａ（：ＴＣＡＴＡＡＣＡＧ ＧＡＧｌＧＧＧＡＡ’ｒｃＡＧＡＧＣ兀℃ＡＣ“；ＧＴ
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ｄｏｍｉｎａｒｉｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＬＤＬＲ ｒｅｓｕｈｅｄ ｆｈ…ｇｃｎｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ
密码子改变产牛Ｃ｜４ Ｃ—ｍ Ｃ（Ｈ５８３Ｙ）．即组氯酸被 酪氨酸取代（见阐５）．同时在第１ ７７３位甲核“酸 Ｔ被ｃ取代，但与ＧｅｎＢａｎｋ比较．无氨基酸的改变， 为ＳＮＰ位点。为验证此处ＳＮＰ位点是青对ＬＤＬＲ 的发生有意义．取２０名正常人的ＤＮＡ模板做此位 点的ＰＣＲ扩增，朱发现有明最差异。
四、其他核心家系ＬＤＬＲ基闺核苷酸序列分析 对先证者母亲及弟弟的［，ＤＬＲ基闲相同片段 测序，未发现１２外显子有１１５８３Ｙ位点的突变；在 １ ７７３位密码子处有与先证者相同的ＳＮＰ改变。，
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３３３
万方数据
渗断学坪论与实践２００５年第４卷第６期
表２ １３名家系成员血脂各项测定结果
图３其中Ⅲ：５为先证者
ＰＣＲ抄增条件为：９５℃预变性１８０ ｓ，９４℃变性 ３０ Ｓ，５５℃～６０℃退火４５ Ｓ，７２℃延伸６０ Ｓ，４０个循 环。ＰＣＲ扩增产物川】．５％琼脂糖凝胶电泳分析鉴
定。ＰＣＲ反应曹体积为２０¨ｌ，包括２洲基因组
图２病理示真皮内成堆泡沫细胞殛淋巴细胞浸润（ｘ１００）
肥同醇（ＬＤＩ，一ｃ１＞４．４ ｍｍｏｌ／Ｌ，患者或亲属有腱黄瘤 者渗断为纯合子Ｆｔｌ，水达纯合了标准者诊断为杂 合子ＦＩＩ。、
二、研究方法 １ ｍ脂测定：采取患者及其家族成员清晨空腹 １２ ｈ血标４‘５ ｎ，ｌ，离心留敷血清。采用酶法测定血
ＤＮＡ、２００ ｇｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、２．５ ｐｍｏｌ／Ｌ引物、１０×缓冲 液２川、２．０ ｎｍｍｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ２ Ｉｘｌ和ＴａｑＤＮＡ聚合酶 ０，２川。每次反应均设【Ｅ常人基因组ＤＮＡ为阳性对 照，同时设空白刘照。，然后Ｈ｛ＰＣＲ产物纯化试剂盒 ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｅ Ｋｉｔ ｆ华舜生物工程有限公司１ 对其ＰＣＲ产物进行纯化．纯化后送测序。
［Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｉ，Ｉ）１．Ｒ）ｇｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ“Ｃｈｉｎｅｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｅｈｏｌｅｓｔｅｍｌｅｍｉａ（ＶＩＩ）ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗａｓ
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二、ａｐｏＢ．。基因Ｑ３５００Ｒ突变检测 结果显示患者及其母亲均未见ａｐｏＢ。。Ｑ３５００Ｒ 突变。从而排除ＦＤＢ（见图４）。 三、患者ＬＤＬＲ基因棱苷酸序列分析 扩增患者ＬＤＬＲ基因包含启动子及伞部１８个 外显子的片段，纯化后进行核苷酸序列分析．以筛查 突变位点。ＬＤＬＲ基因核苷酸序列分析，结果显示患 者ＬＤＬＲ荩岗中的第１２外显子第１ ７４７位单核廿 酸ｃ被Ｔ取代，与ＧｅｎｅＢａｎｋ对照．编码第５８３位
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文章编号：１６７１ ２８７０《２００５）０６—０４７３—０４
Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｆｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ＺＨＯＵ Ｙｕ－ｌｉｎ，ＺＨＡ ０ Ｙｏｎｇ－ｊｕ，ＣＵＩ Ｂｉｎ，，ＵＯ
Ｂａｎｇ－ｙａｏ，ＺＩｔＵ Ｈｏｎｇ－ｄａ．．ＧＵ ｘｌ”＇ｌｆ“§ＬＩ Ｘｉ ｒｕＪ－ｙｉｎｇ，ＮｌＮｃ Ｇｕ，ａａｇ：Ｄｅｐａｒｔｕｗｎｔ《Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ＲｕＴｊｉｎ Ｈｏｓｐｉｔｄ， 聃∽加ａｉ Ｓｅｃｏ删Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉ／ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，航ｍ小ｍ ２０００２５，Ｃｈｉｎａ
患者及其枝心家系成员ａｐｏＢ。，Ｑ３５００Ｒ突变。结论：｝Ｈ是常染色体品性遗传性疾病．为幕冈突变导致ＬＤＩ Ｒ缺｜；ｆｊ 所致的遗传性疚病，椅测相关基凶突坐埘临床十预和遗传指导有参考价值。
关键词：家旌性高删同醇血症： 低＝】许艘脂蛋白受体：基凶突变
中图分类号：Ｈ５９６．１：Ｒ７３９ ５
文献标识码：Ａ
列．设计ＬＤＬＲ荩因启动子及全部１８个外屁子的 引物，分ＳＪＪｘ，十启动子和全部１８个外显予进行ＰＣＲ
囤１ 先证者肘部黄色瘤表现
考ｒ增。同时为排除由ａｐｏＢ，。基因Ｑ３５００Ｒ位点突变 导致的家族性ａｐｏＢ。，缺陷症（ｆａｍｉｌｉａｌ ｄｅｆｅｅｔｉｖｅ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｌⅢ，ＦＤＢ），设计引物进行ａｐｏＢ基因 ０３５（）（）Ｒ突变捡测ｆ各引物序列见表】，引物南上海 生工生物技术有限公司合成１。
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ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ｉｏｒ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｗｏｒｋｓ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｎ－ｈｏ ｅｓｔ ｒｒ ｒｎ ａ；ｈ）ｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ
家旅性高胆吲醇血症（ｆａｎ］ｉｌｉａ】ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓ— ｔｅｒｏｌｅｍｉａ，ＦＨ）是低密度脂蛋白受体ｆＴ．ＤＩ．Ｒ）基因突变 导致的常染色体显性遗传十牛疾病．临床特征为ｌ¨浆 胆固醇明皿升高、皮肤黄色瘤和早发冠心病。ＩＨ分 为杂合ｒ刑和纯合子型，前者发病率为１／５００，后者 约为１／１００万Ｉ １／５００（父）×１／５００（母）ｘｌ／４（可能性）ｌｔ”。 日前最人的ＦＨ数据库（ｗｗｗ．ｕｃｌ＿ａｃ．ｕｋ．舳１显示世界 各地陆续发现Ｔ．ＤＩ．Ｒ基因突变的种类已有８００余 种Ⅲ。本研究应用ＰＣＲ技术对１例临床诊断为ＦＨ 纯合子的中国汉族患者及其家系成员ＬＤＬＲ荩同 进行研究。以探讨其分子机制。
Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ．ｔｈｅ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｍ
（ａｐｏＢｌ【ｘＪ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｋｎｏｗｎ ｎｍｔａｔｉｏｎｓ（Ｒ３５００Ｑ｝ｔｈａｔ ｃａｕｓｅ ｆａｍｉｌｉａｌ ｄｅｆｌｅｃｔｉｖｅ ａｐｏＢｌ㈨（ＦＤＢ）ｗｄｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ Ｒｅｓｕｌｔｓ。Ｉ＇ｗｏ
ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ａｔ １ ７４７ ａｎｄ １ ７７３ ｉ）ｐ ｏｆ ｃｘｎｎ １ ２ ｗｅｒｅ ｆｉ）ｕｎｄ ｉｎ Ｌｈｅ ｐｒｏｂａｎｄ．Ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａ Ｈ５８３Ｙ ｎｌｕｔａｔｉｏｌｌ ａｎｄ
触基数ｆｂｐ）
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材料与方法
一、研究对象
我室门诊收集一ＦＨ家系共１ ３名。先证者女， １７岁，发现肘（见罔１）、膝关节及臀部黄色瘤１０ 年．于２００４年５月束我院就诊。患者７岁时发现肘 关节仲侧出现黄色皮疹．女¨米粒至绿豆人小，无痛 痒感。１３岁起皮疹逐渐增多、增大，并相继山现Ｊ： 臀部及膝关节伸侧。伴阵发性火晕。２００２年４月］‘ 当地医院检查发现血脂升高，同时行臀部皮肤活 榆，病理诊断（她罔２）为臀部脂质代谢性病变，首 先考虑黄脂瘤，予以脂必妥、辛伐他汀治疗，１年后 自觉无好转而停服。我院生化榆查总胆固醇（ＴＣ） ９．４１ ｍｍｏｌ／Ｌ。其母血脂也升高，其父已去世。父母非 近亲结婿，家族中无类似疾病患者，诊断为“ＦＨ纯 合子”。
ＦＨ临床诊断标准Ｈ：成人血清ＴＣ＞７．８ ｍｎｔｏｌ／ｌ。； １６岁以下ＴＣ＞６．７ ｍｍｏｌ／Ｌ或成人低密度脂蛋白一
万方数据
２ ＤＮＡ提取：采取患者及其全部家族成员５ ｍｌ ｍ标本，经ＡＣＤ抗凝．采川常规酚．氯仿法从采集
的ＡＣＤ抗凝血中提取基因组ＤＮＡ。 ３．ＰＣＲ扩增：选取外屁子与内含子相邻的序
诊断学理论‘０宜践２００５年第４卷第６期
．论著·
家族性高胆固醇血症黄色瘤的家系遗传分析
周瑜琳， 赵咏桔， 崔斌， 罗邦尧， 朱簸达，顾雪疆， 李小英， 宁光 （上海第二医科大学附属瑞金医院内分泌代谢科，上海２０００２５）
ｆ摘要１ 目的：检测中吲汉族家族性高胆同醇血症（ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒ—ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｃｍｉａ，ＦＨ）家系低密度脂蛋白璺体 （ＬＤＩ．Ｒ）幕冈完变．探讨ＦＩＩ发病的分子机制。方法：采用ＰＣＲ扩增结合檀甘酸序列分析检测１例临床诊断为ｒ｜Ｉ纯