双元表达载体系统

双元表达载体系统

双元表达载体系统主要包括两个部分：

一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。

与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

原理

1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等

2.双元表达载体系统主要包括两个部分

3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

4.另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。

5.双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的ir基因可以反式激活T－DNA 的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

6.外源DNA克隆到微型Ti质粒T－DNA左右边界序列之间

双元载体

标签:植物双元表达载体

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤细菌，能够通过感染植物的伤口，将其Ti质粒上一段含有植物激素和冠瘿碱合成酶基因的DNA转移并整合至植物受体的基因组中。Ti质粒中的2个独立的区域决定DNA转移及整合：T-DNA区(transferredDNA)和vir区(virlence region)。基于Ti质粒这个结构特点，1983年Hoekema等提出双元载体策略：将去除致瘤基因的T-DNA区从Ti质粒中分离，放置在一个能在农杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭质粒中。这个穿梭载体称为双元Ti载体。vir区则存在于一个已经除去T-DNA的Ti质粒中，在农杆菌中作为辅助质粒，通过反式激活使T-DNA转移到植物细胞基因组中。由于双元Ti载体的体积小而非常便于基因克隆操作，所以逐渐取代了其它形式的Ti载体，已成为植物基因工程中最重要的植物转化载体。(1))病毒载体系统:植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性

所决定的。以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源荃因整合到植物细胞基因组中。植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。

作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。目前己有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中:包括椰菜叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)、更豆花叶病

毒(CPMV)和马铃薯X病毒(PVX)等。其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有

150种以上。

(2)农杆菌质粒载体系统:质粒载体系统中最常用的质粒有:Ti质粒和Ri质粒。r

质粒存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumcfaciens )中，Ri质粒存在于发根农杆菌(Agxobac[erium tlhixogenis)中。r质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有荃本一致的特性。但实际工作中，绝大部分采用五质粒。农杆菌质粒是一种能实现DNA 转移和整合的天然系统。r质粒有两个区域:T -DNA区〔是质粒上能够转移整合入植物受体墓因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘦瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域)和Vir区(编码能够实现TDNA转移的蛋白)。TDNA长度为12一24kb之间，两端各有一个含25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的TDNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的 TDNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。Vir区位于TDNA 以外的一个 35kb内，其产物对TDNA的转移及整合必不可少。农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达。Vir产物能诱导Ti质粒产生一条新的TDNA单链分子。此单链分子从五质粒上脱离后，可以与场r 产物VIRD2 蛋白共价结合，并在V [RD4和V IRE等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。由于野生型Ti质粒过于庞大，约200一S00kb，为了便于重组DNA操作，

研究人员对Ti 质粒进行了改造从而构建一系列合适的Ti衍生载体。首先除掉了野生型Ti 质粒TDNA区的一段DNA片段。例如:参与植物生长素和细胞分裂素的基因(这些基因过度表达植物激素，从而破坏受体细胞和激素产量)。此外需在T质粒上加上E. Coli复制起始位点，使得插入外源基因的r质粒在为一个穿梭载体，不但可在农杆菌中复制，而且便于在E. Coli中重组操作与保存。3甲植物转化载体系统(包括一元载体系统和双元载体系统)。人们在研究中发现在T -DNA转移过程中，明r基因并不一定与T -DNA位于同一个质粒上，于是通过构建中间载体解决了T质粒不能直接导入目的基因的困难。

大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性，因此研究者可以将T -DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的Ti质粒上。这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T -DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组TDNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为“中间载体”(intermediate 4wtor),而接受中间费休的Ti质粒则森为等休T质粒( aevenfor T nlasmid ) .一船早知甲费体或称“缴械”载体。在这种omc-载体中已经缺失的T DNA部分被大肠杆菌的一种常用质粒 pBR322取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒的外源DNA片段都可以与pBR322质粒DNA 同源重组，而被其整合到one一Ti质粒载体上。中间载体通常是多拷贝的B. coli小质粒，这一点对下通过体外操作导入外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类中间载体:即共整合系统中间载体和双元系统中间载体。

根据两类中间载体，目前己开发出两类转化体系:一类是一元载体系统(整合载体系统)，这一类载体系统由一个共整合系统中问表达载体与改造后的受体卫质粒组成。在农杆菌内，通过同源重组将外源基因整合到修饰过的TDNA上，形成可穿梭的共整合载体，在Vir基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。但这类方法构建困难，整合体形成率低，一般不常用。

另一类转化体系是双元载体系统，它由两个分别含有TDNA和Vir区的相容性突变Ti 质粒即:微型r质粒(mini一plasmid)和辅助Ti质粒(helper Ti plastnid)构成，TDNA 和Vir 基因在两个独立的质粒上，通过反式激活TDNA转移到植物细胞基因组内。微型Ti 质粒就是含有TDNA边界缺失Vir基因的r质粒，为一个广谱质粒。它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点(oriv)，同时具有选择性标记基因。辅助质粒为含有Vir区段但 TDNA

缺失的突变型质粒，完全丧失了致瘤的功能。因此相当于共整合载体系统中的卸甲质粒。其作用是提供Vr基因功能。激活处于反式位置上的TDNA转移。将微型质位转入到含有辅助性Ti质粒农杆菌的途径有两条:一条是直接用纯化的微型Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞;另一条途径是采用三亲交配方法，三亲交配由含微型Ti质粒的E. Coli,含有助动质粒pRK2013的E.Cali和含有辅助Ti质粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌问的接合转导。pRK2013可移入农杆菌，但由于不能自主复制而被丢失，其进入含有微型Ti质粒的E. Coli后，可促进微型Ti质粒一起或分别转移入农杆菌中。但由于 pRK2013的“自杀”特性，最终在农杆菌中剩下微型Ti质粒和Ti质粒双元载体，此农杆菌可直接用于植物细胞转化。双元载体不需经过两个载体的共整合过程。因此构建的操作过程比较简单:由于微型