基因工程实验教学教案

基因工程实验

教学方案

湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室

指导教师:吴娟

实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株

Ⅰ质粒DNA的提取

实验目的

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。

实验原理

1.碱变性法基本原理是,在Ph1

2.０-１２．6碱性环境中,线性的大分子量细菌染色体DＮA变性,而共价闭环质粒ＤNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DＮA仍为可溶状态,通过离心可除去大部分细胞碎片,染色体DNＡ,RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。

2．设计构建体外重组DNA分子

构建体外重组ＤＮＡ分子,首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源ＤNA基因。构建体外重组ＤＮA分子,最简单的重组方式就是在目的基因DＮA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解,产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的,重组的效率高,也易于筛选处重组子。

附表达载体pGEX－6P-1－mreB的构建图：

仪器材料与试剂

（一)仪器

1.恒温摇床

2.台式离心机

3．漩涡混合仪

(二)材料与试剂

１.含pＧEＸ-mreB质粒的大肠杆菌DＨ5α

2. 含pGEX质粒的大肠杆菌DH５α

３.液体LＢ培养基

4.１００mg／ｍL氨苄青霉素Amｐ

５.新捷质粒提取试剂盒

实验步骤

分为两组:一组提取质粒pGEＸ-mreB，另一组提取质粒pGEX。

１）12０00rmｐ离心30秒收集1－5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入2５0ｕｌ已加入RnａsｅＡ的BｕfferⅠ, 充分悬浮细菌沉淀。

2）加入２50ul BuffｅrⅡ, 温和并充分地翻转离心管4-6次。

3）加入３50ul Ｂuffer Ⅲ，温和并充分地翻转离心管4-6次。

4)13000 rｍp 离心10分钟。

5)将核酸纯化柱置于2ml 离心管中,转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中,盖上管盖，1２000rmp离心3０秒。

６)弃2mｌ离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到２ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ul Buffer W2,盖上管盖,１2000rmp离心30秒。

7)弃２ml离心管中的滤液,将核酸纯化住置回到２ｍｌ离心管中，14000 rmp离心1分钟。

８)弃２mｌ离心管,将核酸纯化住置于一个洁净的1．５ｍl离心管中,在纯化柱的膜中央加入50-１00ul Bufｆer ＴＥ，盖上管盖,室温静置１分钟，１２０００ｒｍp离心3０秒。

9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-2０℃。

实验结果

实验安排

3个小时

Ⅱ质粒ＤNA的转化

实验目的

通过本实验,掌握大肠杆菌转化的方法与技术。

实验原理

细菌处于容易吸收外源DＮA的状态称感受态。转化是指质粒ＤNA或以其为载体

低渗溶液中,菌细构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃、CaCl

2

胞膨胀成球形。转化混合物中的DNＡ形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸DNA复合物粘附于细胞表面，经４2℃短时间热激处理，促进细胞吸收DＮA复合物。将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Ａmp r等）得到表达，然后将此细胞培养物涂在选择性培养基上。

E.cｏｌi DＨ5α是一种用于质粒克隆的菌株。

E.cｏli BL21是一种适合于外源蛋白表达的菌株，其内源性的蛋白酶基因缺失。

仪器材料与试剂

（一)仪器

1.超净工作台

2.恒温摇床

3.制冰机

4.高压灭菌锅

(二) 材料与试剂

1.大肠杆菌Bl21感受态细胞

2．质粒ＤNA：ｐGEX－mre B、pGEX。

3．固体LB培养基平板（含Ａmｐ120ug/ml)

实验步骤

分为两组：一组加入质粒ｐGＥX－mｒeＢ，另一组加入质粒pGＥＸ。

1．取1０0ｕｌ新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA 2ｕｌ混匀,冰上放置30min。

同时做一个对照管，仅加入100ul感受态细胞，不加质粒。

2.将管放到42℃热激９０ｓ。

3.冰浴2mｉn。

4.每管加400ul ＬＢ液体培养基，37℃培养1h(1５0r/min)

５.将适当体积（200ul)的复苏细胞，涂布在含有氨苄青霉素的ＬＢ培养皿中,正置平皿3０min。

6．倒置平皿3７℃培养12-１6h,出现菌落。

实验结果

实验安排

这整个大实验从质粒提取到转化需一天,第二天早晨观察结果。

实验二外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测

Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

实验目的

通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。

实验原理

将外源基因mreB克隆在含有Tac启动子的表达载体pGEＸ中,让其在Ｅ．coｌi 中表达。先让宿主菌生长，lａcI产生的阻遏蛋白与ｌaｃ操纵基因结合,从而不能进行外源基因的转录及表达,此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入ｌac操纵子的诱导物IPＴG(异丙基-β－Ｄ-硫代半乳糖苷),阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经ＳＤS-PAGE进行检测,或做蛋白质印迹，用抗体识别表达蛋白。

Tａc启动子:Ｔac启动子是一组由Lac和ｔrp启动子人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tａc 1是由Trp启动子的-35区加上一个合成的４6 bp DNA片段（包括Ｐribnow盒)和Lac操纵基因构成，Taｃ12是由Trp 的启动子－35区和Lac启动子的-10区,加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Ｔac启动子受ＩＰTG的诱导。