人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的比较研究

步骤。本研究着眼于临床组织工程的实际需求， 对 Ｆｉｃｏｌｌ 密度梯度离心法与全骨髓培养法分离培养人 ＭＳＣｓ 的效果进行了探索和比较， 现报告如下。 １ 材料与方法 １．１ 骨髓标本来源： 来源于非造血系统疾病的患者 或骨髓移植供者髂骨骨髓， 共 ７ 例， 男 ２ 例， 女 ５ 例， 平均年龄 ３４ 岁。患者及家属均知情并同意捐献。 １．２ ＭＳＣｓ 的分离与培养： 取骨髓血 ６￣ ７ｍｌ， 将 采 集 的抗凝骨髓经等量高糖 ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 稀释后， 等量分 为两份， 分别进行以下分离培养： 全骨髓培养法组 （ Ａ 组 ） ： 每 １ｍｌ 稀 释 骨 髓 血 与 ４ｍｌ 含 体 积 分 数 为
代。传代后细胞生长速度快， 形成较为均一的长梭
形 、多 角 形 细 胞 ， 其 他 形 态 的 细 胞 极 少 见 ， 一 般 ７～
１０ｄ 便可达 ７０％～８０％融合， １４～１８ｄ 左右出现致密的
贴壁层。
密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞后， 在相
同接种密度的条件下用含国产胎牛血清的培养基进
行培养 ＭＳＣｓ 的成功率（ ３／７） 明显低于含进口胎牛血
间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ＭＳＣｓ）又 称中胚叶未分化间质干细胞， 具有多向分化潜能， 在 特定的条件下可向成骨细胞、软骨细胞、血管内皮细 胞及神经细胞分化， 且具有容易分离、扩增、外源基 因易于导入和表达等优点， 是一种重要的组织工程 种子细胞［１￣ ３］。临床上自体 ＭＳＣｓ 移植已用于治疗骨、 软 骨 、心 脏 、神 经 系 统 疾 病 等 。 目 前 已 从 骨 髓 、脐 带 血、脂肪组织、松质骨等组织中成功分离 ＭＳＣｓ， 但就 临床应用而言， 最方便快捷的来源是骨髓。然而 ＭＳＣｓ 在骨髓中含量稀少， 如何快速、有效地体外扩 增 ＭＳＣｓ， 是提高患者康复和生活质量改善的关键性
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１０％ＦＢＳ（ Ｈｙｃｌｏｎｅ 公 司 ） 的 ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ 美 国 ＧＩＢＣＯ 公司） 培养液以吸管混匀后， 直接接种于 ５０ｍｌ 培养 瓶（ 美国 Ｃｏｓｔｅｒ 公司） 中进行培养， 首次换液为全量 换液。密度离心法组（ Ｂ 组）： 取 １０ｍｌ 稀释骨髓血， 沿 管壁缓慢加于 Ｆｉｃｏｌｌ－ Ｈｙｐａｑｕｅ 淋巴细胞分离液 （密 度 为 １．０７７ｇ／ｍｌ， 上 海 华 精 生 物 ）面 上 ， ２５００ｒ／ｍｉｎ， 离 心 ２５ｍｉｎ。吸取交界面单个核细胞层， ＰＢＳ 洗涤 ３ 次 后， 以含体积分数为 １０％ＦＢＳ （ 杭州四季青公司或 Ｈｙｃｌｏｎｅ 公司产品） 的 ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培养液重新制成 细胞悬液后， 按 １×１０６／ｍｌ 密度接种于 ５０ｍｌ 培养瓶 中进行培养。上述两组培养条件均为 ３７℃， ５％ＣＯ２， 饱和湿度下培养。定期置于倒置相差显微镜下观察 与照相， 并分别记录各瓶长满后首次传代的时间， 如 于 ２１ｄ 之 内 无 法 长 满 培 养 板 底 ８０％以 上 即 视 为 不 成功。当细胞铺满培养板底 ８０％以上时进行胰酶消 化， １： ３ 传代接种于 ５０ｍｌ 培养瓶中， 传至第 ３ 代， 计 数上述各组获取 ＭＳＣｓ 的平均细胞数。 １．３ 流式细胞术分析 ＭＳＣｓ 细胞表面标志： 将第 ２ 代 ＭＳＣｓ 细胞用 ＰＢＳ 洗涤后， 用 ＰＢＳ 重新悬浮细胞， 制 成 １×１０６／ｍｌ 的细胞悬液加入流式细胞检测试管， 每 管 ２５０μｌ， 在 各 管 中 分 别 加 入 以 下 抗 体 １０μｌ （ 除 ＦＩＴＣ－ ＣＤ１０５ 购自 Ａｎｃｅｌｌ 公司， 其余均购自美国 ＢＤ 公司） ： ＣＤ３４－ ＦＩＴＣ／ＣＤ１６６－ ＰＥ、ＣＤ２９－ ＰＥ／ＨＬＡ－ ＤＲ－ Ｐｃ５、ＣＤ１０５－ ＦＩＴＣ／ ＨＬＡ－ ＤＲ－ Ｐｃ５， 室 温 温 育 ３０ｍｉｎ， ＰＢＳ 洗去未结合抗体， 用流式检测缓冲液 １ｍｌ 重悬 细胞， 上流式细胞仪（美国 ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ 公 司）检测， 以同种荧光标记的 ＩｇＧ１ 抗 体 作 为 阴 性 对 照确定背景标记， 同一条件检测其他各管的细胞， 每 次至少分析 ５０００ 个细胞， 检测阳性率。 １．４ 统计学方法： 所有数据用 ＳＰＳＳ１０．０ 软件进行处 理 ， 数 据 以 （ ｘ±ｓ） 表 示 ， 计 量 资 料 采 用 ｔ 检 验 ， 以 Ｐ＜ ０．０５ 为差异有统计学意义。 ２ 结果 ２．１ ＭＳＣｓ 细胞生长、形态的观察： 全骨髓培养法： 接 种后红细胞很多， 覆盖整个培养瓶底。１ｄ 后透过红 细胞层即可见散在白色小细胞团， ２～３ｄ 见白色细胞 团增大， 第 ３ｄ 后全量换液， 大量血细胞被除去， 仍有 部分血细胞悬浮， 白色细胞团消失， 可见散在贴壁的 梭形细胞， 分布不均， 部分呈巢状生长。６～９ｄ 可见形 成多个成纤维样细胞集落， 集落周围可见其他细胞 生长， １２～１７ｄ 成纤维样细胞细胞增多汇集成片可以 传代。密度梯度离心法： 刚接种的细胞呈球形悬浮于
以后增殖变慢， １０～１２ｄ 传代 １ 次； 至第 ８ 代左右， 细
胞生长缓慢， １３～１９ｄ 才长满瓶底， 细胞伸展较大， 不
பைடு நூலகம்
规则， 胞质稀薄， 细胞中出现颗粒， 折光性弱， 同时伴
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人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的比较研究
丁伟荣 １ 吴晓牧 １ 饶燕飞 ２ 杨志刚 １ 柳 喆 １ 张水生 １ （ １ 江西省人民医院干细胞重点实验室； ２ 南昌大学第二附属医院检验 科， 南昌， ３３０００６）
摘要 目的 比较 Ｆｉｃｏｌｌ 密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ＭＳＣｓ）与全骨髓培养法之间的差异， 以 期建立一种简便、实用的基于临床移植需要的 ＭＳＣｓ 分离方法。方法 分别应用上述两种方法分离 ＭＳＣｓ， 比较用两种方法的细 胞形态、ＭＳＣｓ 细胞得率及以及细胞表面标志的差异。结果 两种方法均能有效培养出骨髓 ＭＳＣｓ， 且获得的第二代 ＭＳＣｓ 细胞形 态无明显差异， 细胞形态均一， 为长梭形或三角形。５ｍｌ 骨髓细胞分离培养后， Ｆｉｃｏｌｌ 密度梯度离心法获得的 ＭＳＣｓ 细胞总数显著 小于全骨髓培养法（ｔ＝２．６３９， Ｐ＜０．０１）。Ｆｉｃｏｌｌ 密度梯度离心法与全骨髓培养法获得的第二代 ＭＳＣｓ ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０５、ＣＤ３４ 阳 性表达率的差异无统计学意义（ｔ 分别为 ０．８０９、０．６５９、０．２７７、０．１９１， Ｐ 均＞０．０５）， 但前者的 ＨＬＡ－ ＤＲ 阳性表达率明显低于后者， 差 异具有统计学意义（ ｔ＝２．３４７， Ｐ＜０．０５） 。结论 与 Ｆｉｃｏｌｌ 密度梯度离心法相比较， 全骨髓培养法分离 ＭＳＣｓ 具有培养时间较短， 细胞 得率较多的优点， 虽纯度相对较低， 但仍是一种较好的 ＭＳＣｓ 分离方法。 关键词 间充质干细胞； 骨髓； 细胞培养 中图分类号： Ｒ３３１．２ Ａ ｃｏｍｐａｒ ａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｗｏ ｃｕｌｔｕｒ ｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒ ｒ ｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ Ｄｉｎｇ Ｗｅｉｒ ｏｎｇ１，Ｗｕ Ｘｉａｏｍｕ１，Ｒａｏ Ｙａｎｆｅｉ２，ｅｔ ａｌ（１Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｋｅｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｊｉａｎｇｘｉ ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ ｐｅｏｐｌｅ’ｓ ｈｏｓｐｉｔａｌ；２ Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＮａｎＣｈａｎｇ， ３３０００６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｆｉｃｏｌｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｔｈｏｄ ａｓ ｓｏｌｕｔｅｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ （ＭＳＣｓ）ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｖｏｌｕｎｔａｒｙ ｎｏｒ－ ｍａｌ ａｄｕｌｔｓ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ－ ｍａｒｋｅｒｓ ａｆｔｅｒ ｔｗｏ ｐａｓｓａｇｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｏｆ ｖｏｌｕｎｔａｒｙ ｎｏｒｍａｌ ａｄｕｌｔｓ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ａｂｏｖｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｓｐｉｎｄｌｅ－ ｌｉｋｅ ｏｒ ｔｒｉａｎｇｌｅ－ ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ＭＳＣｓ ｇａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆ－ ｆｅｒｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＭＳＣｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｗａｓ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｙ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｔｈｏｄ （Ｐ＜０．０１）．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ＣＤ２９， ＣＤ－ １０５， ＣＤ１６６ ａｎｄ ＣＤ３４ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｏｒ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ（Ｐ＞０．０５）．Ｂｕｔ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ＨＬＡ－ ＤＲ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｄ－ ｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｙ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｔｈｏｄ （Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ａ ｌｏｗｅｒ ＭＳＣｓ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＭＳＣｓ．ＭＳＣｓ ｃａｎ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｆａｃｔ ａｎｄ ｄｅｍａｎｄ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ； ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ｓｅｅｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ； ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
清的培养基的成功率（７／７）， 两者之间差异具有统 计
学意义（Ｐ＜０．０５）。
２．２ ＭＳＣｓ 的 传 代 培 养 ： 上 述 两 种 方 法 分 离 培 养 的
ＭＳＣｓ 细胞在完全培养液下， 细胞的贴壁时间， 传代
次数均无差别， １： ３ 传代可以连续传代 ８ 代。３～４ 代
以前 ＭＳＣｓ 生长迅速， 平均 ７～９ｄ 传代 １ 次； ５～７ 代
江西医药 ２００７ 年 第 ４２ 卷 第 ２ 期
培养液， 并混有少量血细胞。第 １～２ｄ 可见少量单个
核细胞贴壁， 细胞形态开始变形， 第 ３ｄ 后全量换液，
可见贴壁细胞变成梭形或多角形， 分布不均， ６～１２ｄ
贴壁细胞逐渐增多， 部分呈巢状生长， 形成多个成纤
维 样 细 胞 集 落 ， １４～２０ｄ 细 胞 逐 渐 汇 集 成 片 可 以 传