苯丙氨酸解氨酶活性的测定

实验步骤
三、酶粗提液的制备 经诱导处理的马铃薯圆片各 5g，分别加10ml含5mmol/L 的巯基乙醇的硼酸缓冲 液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、少量石英砂在研 钵中研磨。匀浆用尼龙袋过滤，滤液经10000r/min 离心15min，上清液为酶粗提液。上述操作均在0～ 4℃下进行。
实验步骤
实验
苯丙氨酸解氨酶活性的测定
实验原理
• 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）催 化苯丙氨酸的脱氨反应，使NH3释放出来 形成反式肉桂酸。此酶的在植物体内次生 物质（如木质素等）代谢中起重要作用。 根据其产物，反式肉桂酸在290nm处吸光 度的变化可以测定该酶的活性。
实验步骤
一、1. 马铃薯圆片制备 将马铃薯块茎洗净、削皮， 用打孔器（直径1cm）取圆柱，切除两头近表皮处， 中间部分切成2mm厚的圆片。先用自来水漂洗，最 后用蒸馏水洗一次，用纱布吸干表面的水。
二、 光诱导 将圆片平铺在湿润滤纸的培养皿中， 一组置20～30℃红光下处理24h以诱导PAL（也可接 种病原菌诱导等）；另一组置于黑暗中。
实验结果
• 苯丙氨酸解氨酶在290nm处吸光度为1.770
四、 活性测定与计算 1ml酶液加1ml0.02mol/L 苯 丙氨酸，2ml蒸馏水，总体积为4ml。对照不加底物， 代之以1ml含巯基乙醇的硼酸缓冲液。反应液置恒温 水浴30℃中保温，0.5h后用紫外分光光度计在 290nm处测定吸光度。以每小时在290nm处吸光度 变化0.01所需酶量为一单位（相当每毫升反应混合 物形成1μg肉桂酸）。
实验仪器
（一）材料：马铃薯块茎
（二）仪器设备：1. 紫外分光光度计；2. 离心机； 3. 研钵；4. 培养皿；5. 红光装置；6. 打孔器；7. 恒温水浴
Hale Waihona Puke Baidu
实验试剂
1、 0.05mol/L 硼酸盐缓冲溶液（pH8.8）； 2、 0.02mol/L 苯丙氨酸（用0.1mol/L pH8.8硼 酸缓冲液配制）； 3、 5mmol/L 巯基乙醇硼酸缓冲液。