实验三 培养基的制备及玻璃器皿的包扎灭菌 实训指导书

实验三培养基的制备及玻璃器皿的包扎灭菌

【目的要求】

1、掌握培养基的制备方法。

2、掌握高压蒸气灭菌技术。

3、熟悉玻璃器皿的包扎方法。

【材料和用品】

1、溶液或试剂

10%HCl、10%NaOH、营养琼脂、蒸馏水、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。

2、仪器或其他用具

pH试纸、培养基分装器、高压蒸气灭菌锅、玻璃棒、天平、牛角匙、记号笔、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、量简纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）。

【实验内容与方法】

（一）培养基的配置

1、营养琼脂培养基的配制

其配方法如下：按比例配方配制营养琼脂培养基。

（1）称量和溶解

按培养基配方逐一称取营养琼脂粉加入烧杯中，再加定量无菌水，用玻棒搅匀，加热溶解，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量。注意：在加热融化时要不断搅拌，避免琼脂糊底烧焦。

（2）调节pH

用精密pH试纸测培养基的pH，按pH的要求用质量浓度100g/L NaOH或体积百分数10%HCl调整至所需pH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测试其pH值。

（3）补水至刻度

（4）过滤

趁热用纱布过滤即可。如果培养基杂质很少或实验要求不高，可不过滤。

（5）分装、包扎

玻棒引流于锥形瓶内，塞上棉塞，用报纸包扎。

注意：在玻棒引流时，避免瓶口沾上培养基而引起杂菌感染

2、高压蒸气灭菌的操作过程

（1）加水

立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。有加水口者由加水口加入至止水线处。（2）装锅

把需灭菌的器物放入锅内（请注意：器物不要装得太满，否则灭菌不彻底），加盖时将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。关严锅盖（对角式均匀拧紧螺旋）。

（3）加热

用电源或煤气加热，同时打开排气阀，使水沸腾以排出锅内的冷空气。待冷空气完全排出后关上排气阀。让锅内温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

（4）中断热源

达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到0时，打开排气阀（请注意，排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，内外压力不平衡而翻腾冲到棉塞处，既损失培养基又玷污了棉塞）。

（5）揭开锅盖，

取出器物，排掉锅内剩余水。灭菌需待培养基冷却后置于37 度恒温箱内培养24小时，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。

（二）玻璃器皿的包扎

1.洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。

2.包装

（1）移液管包装

将干燥的移液管的吸端用细铁丝塞入少许棉花构成1～1.5cm长的棉塞，以防细菌吸入

口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4～5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。包好的多个移液管可再用一张大的报纸包好。（2）试管和三角瓶等的包装

用棉塞或泡沫塑料塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住然后在棉塞与管口和瓶口的外面用两层报纸与细线（或用铝箔）包扎好，放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。

（3）培养皿的包装

培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将每套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外）包好。如果将培养皿放金属筒内进行干热灭菌，则不必用纸包。

空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。

3、灭菌——干热灭菌法

培养皿、移液管、试管及其他玻璃器皿可用干热灭菌。先将已包装好的上述物品放入恒温箱中，将温度调至160度后维持2小时，把恒温箱的调节旋扭调回零处，待温度降到50度左右，才可将物品取出。

请注意：灭菌时温度不得超过170度，以免包装纸烧焦。灭菌好的器皿应保存好，切勿弄破包装纸，否则会染菌。

4、灭菌约需1小时，期间大家可以去吃饭或者休息。灭完菌后，趁培养基冷却凝固之前分装到培养皿中，盖上盖子，让培养基冷却凝固。每组拿着培养皿选取校园某一个地点，测量空气中微生物的含量。具体操作方法如下：打开培养皿的盖子，在空气中暴露5分钟，盖上盖子，放到恒温培养箱中培养24小时。24小时后来观察结果。

【实验报告】

按实验目的的要求完成实验内容和实验报告，报告要求：

1. 简述如何制备培养基

2. 写出玻璃器皿包扎灭菌的注意事项。

【实验结果讨论】

1.培养基根据什么原理配制成？肉膏蛋白胨琼脂培养基中不同成分各起什么作用？

2.在制备培养基的过程中应注意些什么问题？

3.说明选择的测量地点是哪里，必要时画图说明。各组数出培养基上菌落的个数，在实验报告中写清楚。