琼脂扩散实验 PPT
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花孔型
单向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。 将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝 固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入 抗原，每孔10μL，放置湿盒中，37℃温箱，抗原就会 向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h －48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。 沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓 度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本 中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫 球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
A1：待检抗原；A2：标准抗原
免疫学及免疫学检验
抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体 的效价。
实验
材料与试剂
1．琼脂粉 2．平皿 3．打孔器 4．生理盐水或其他缓冲液 5. 抗原、抗体
操作方法
1．称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理
琼脂扩散试验
一、实验目的
学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用 熟悉掌握其基本操作方法
二、实验原理
沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在 二者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下， 可形成肉眼可见的沉淀物的反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自பைடு நூலகம்扩 散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物 分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可 见的带状或线状沉淀带。
盘中，37℃自由扩散24h～48h。
结果判定
．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中 心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻 孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原； 若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇； 若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。
双向免疫扩散凝胶染色图
3 4
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
双向琼脂扩散试验
测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝 固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗 原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗 原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗 体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白 色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因 此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已 知抗原鉴定抗体。
另外沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原，抗体的特 异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗 原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线， 因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比 较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。
○○ ○
三孔型
○○ ○○
双排孔型
○○
双孔型 ○
○○○ ○
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂 糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允 许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由 通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上， 所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼 脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明 度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀 检测技术中最理想的扩散介质。
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2 1
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1.双扩散用于疾病诊断： 以 IBD诊断为例，中心孔加IBD 标准阳性血清，周围孔分别 加IBD标准抗原、生理盐水、 待检抗原1.2.3.4。
2.双扩散用于抗体检测： 以 免疫鸡IBD抗体检测为例，中 心孔加IBD标准抗原，周围孔 分别加IBD标准阳性血清.、 IBD阴性血清、待检血清
1.2.3.4。
盐水或缓冲液，煮沸融化。
2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～ 3mm。自然冷却。
3．根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心 之间的距离，包括两孔的半径3－5mm）打成梅 花形孔图。
4．挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。 5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许
熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。 6．吸取样品加入孔内(约15ul)，，以加满为度。 7．加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿
沉淀线的形状、位置，与抗原的浓度、扩散速度 相关。
琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂 中进行。又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散 试验两类。
应用
（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估 算。
（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带
根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之 间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原 的组成。
免疫扩散
免疫学及免疫学检验
沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系
A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＞ Ab ； C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＜ Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag ＞ Ab ； E：浓度Ag ＞ Ab，扩散率Ag ＞ Ab ；F：浓度Ag ＜ Ab，扩散率Ag ＜ Ab
免疫学及免疫学检验
(1) 沉淀线吻合：待检抗原 与标准抗原完全相同。
(2) 沉淀线相切：待检抗原 中含有与标准抗原相同的 抗原，还含有另外的抗原 与抗血清相对应。
(3) 沉淀线相交：待检抗原 有与抗血清对应的抗原， 但和标准抗原不同。
(4) 沉淀线部分吻合：待测 抗原和标准抗原性质相同， 但含量较低。
单向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。 将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝 固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入 抗原，每孔10μL，放置湿盒中，37℃温箱，抗原就会 向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h －48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。 沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓 度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本 中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫 球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
A1：待检抗原；A2：标准抗原
免疫学及免疫学检验
抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体 的效价。
实验
材料与试剂
1．琼脂粉 2．平皿 3．打孔器 4．生理盐水或其他缓冲液 5. 抗原、抗体
操作方法
1．称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理
琼脂扩散试验
一、实验目的
学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用 熟悉掌握其基本操作方法
二、实验原理
沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在 二者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下， 可形成肉眼可见的沉淀物的反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自பைடு நூலகம்扩 散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物 分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可 见的带状或线状沉淀带。
盘中，37℃自由扩散24h～48h。
结果判定
．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中 心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻 孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原； 若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇； 若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。
双向免疫扩散凝胶染色图
3 4
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
双向琼脂扩散试验
测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝 固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗 原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗 原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗 体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白 色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因 此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已 知抗原鉴定抗体。
另外沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原，抗体的特 异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗 原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线， 因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比 较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。
○○ ○
三孔型
○○ ○○
双排孔型
○○
双孔型 ○
○○○ ○
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂 糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允 许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由 通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上， 所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼 脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明 度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀 检测技术中最理想的扩散介质。
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1.双扩散用于疾病诊断： 以 IBD诊断为例，中心孔加IBD 标准阳性血清，周围孔分别 加IBD标准抗原、生理盐水、 待检抗原1.2.3.4。
2.双扩散用于抗体检测： 以 免疫鸡IBD抗体检测为例，中 心孔加IBD标准抗原，周围孔 分别加IBD标准阳性血清.、 IBD阴性血清、待检血清
1.2.3.4。
盐水或缓冲液，煮沸融化。
2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～ 3mm。自然冷却。
3．根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心 之间的距离，包括两孔的半径3－5mm）打成梅 花形孔图。
4．挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。 5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许
熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。 6．吸取样品加入孔内(约15ul)，，以加满为度。 7．加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿
沉淀线的形状、位置，与抗原的浓度、扩散速度 相关。
琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂 中进行。又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散 试验两类。
应用
（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行初步估 算。
（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带
根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之 间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原 的组成。
免疫扩散
免疫学及免疫学检验
沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系
A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＞ Ab ； C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＜ Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag ＞ Ab ； E：浓度Ag ＞ Ab，扩散率Ag ＞ Ab ；F：浓度Ag ＜ Ab，扩散率Ag ＜ Ab
免疫学及免疫学检验
(1) 沉淀线吻合：待检抗原 与标准抗原完全相同。
(2) 沉淀线相切：待检抗原 中含有与标准抗原相同的 抗原，还含有另外的抗原 与抗血清相对应。
(3) 沉淀线相交：待检抗原 有与抗血清对应的抗原， 但和标准抗原不同。
(4) 沉淀线部分吻合：待测 抗原和标准抗原性质相同， 但含量较低。