骨髓瘤细胞
2、骨髓瘤细胞的选择和培养
骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，与脾细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。所选择的骨髓瘤细胞需满足以下条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml;④生长速度快，繁殖时间短。
本实验选择满足上述条件的SP2/0细胞株，取出冻存的细胞株进行复苏：从液氮中取出冻存管，立即置37℃水浴中融化细胞。将细胞直接加入10ml含15％小牛血清的RPMI-1640培养液中，置37℃ 5％CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。悬浮细胞待细胞全部沉降后小心吸去上清液，更换新鲜的上述培养液，继续培养。复苏时需注意：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
将预先消毒好的细胞培养瓶、吸管等，经高温灭菌冷却后转入消毒柜保存并待使用时取出。采用基础培养基DMEM进行培养，由于配制培养基的水的质量是影响融合的关键素，所以至少应用三蒸水或四蒸水，并定期检查制成的纯水质量。所添加的血清成分也对培养基的影响很大，故通常使用初生犊牛血清配制培养基，血清的质量也要进行严格的筛选和把关。
最后在进行细胞融合前还需将骨髓瘤细胞经过8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性。在融合前24h给细胞培养瓶换液一次，并使细胞处于对数增长期。
3、饲养细胞
在体外的细胞培养中，饲养细胞的加入使其它单个的或数量很少的活的细胞更易生存与繁殖。单克隆的选择过程就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，故在细胞融合这一过程中须使用饲养细胞。它们可以释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可以控制新生杂交瘤细胞的细胞密度。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片
的作用，所以使用最为普遍。
选用小鼠(Balb/c）若干只，事先准备好的高压灭菌后的11.6%蔗糖溶液。
(1)拉颈处死小鼠。 (2)70%酒精浸泡消毒10min。 (3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。 (4)用注射器将4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。 (5)1000r/min离心10min。 (6)取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。 (7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。
实验材料：SP2/0细胞株、15％小牛血清、RPMI-1640培养液、水浴锅、细胞培养箱、DMEM培养基、8-AG培养基、小鼠、11.6%的蔗糖溶液、HAT选择培养基、计数板、台盼蓝溶液
注意事项：
1、所有的使用器材都必须经过消毒灭菌。
2、冻存的细胞株复苏时需注意：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
3、由于配制培养基的水的质量是影响融合的关键素，故通常要使用三蒸水或四蒸水。
杂交瘤细胞制备
杂交瘤细胞的制备 1. 骨髓瘤细胞的准备 选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，大小均一，边缘清晰，排列整齐，呈半致密分布。弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用10mL不完全培养基将骨髓瘤细胞（SP2/0）轻轻吹下。 2. 脾淋巴细胞的准备 a、取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。 b、颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒体表5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。 c、无菌打开腹腔取出脾脏，用基础培养基洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。 d、随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。 3. 饲养细胞的制备 取一只健康的ICR小鼠，摘眼球采血，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10mL注射器，12#针头，注射5-10mL HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。 4. 细胞融合 a、将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50mL的带盖的离心管中，1000rpm离心10min，上清要充分吸净，以免影响PEG的作用。 b、将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，务使两种细胞充分混匀。 c、用1mL吸管将预热的PEG在45~60s内缓慢加到融合管中，边加边轻轻摇匀。 d、立即滴加37℃预热的DMEM，使PEG稀释而失去作用，具体加法是用吸管在第一分钟内加1mL预热的不完全培养基，第二分钟内加2mL，第三分钟加8mL （遵照先慢后快的原则），37℃静置10min，1000rpm离心10min，弃上清。 e、加入5mL的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50mL左右。 f、分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃，5%CO2培养箱内培养。 g、5d后用HAT培养基换出一半培养基。 h、观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。
多发性骨髓瘤(MM)
多发性骨髓瘤（MM） 定义：多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓中积聚浆细胞为特征的恶性肿瘤，可导致骨质破坏和骨髓衰竭。临床表现 多发性骨髓瘤起病徐缓，早期无明显症状，容易被误诊。主要有贫血、骨痛、肾功能不全、感染、出血、神经症状、高钙血症、淀粉样变等。 1.骨痛、骨骼变形和病理骨折 骨髓瘤细胞分泌破骨细胞活性因子而激活破骨细胞，使骨质溶解、破坏，骨骼疼痛是最常见的症状，多为腰骶、胸骨、肋骨疼痛。由于瘤细胞对骨质破坏，引起病理性骨折，可多处骨折同时存在。 2.贫血和出血 贫血较常见，为首发症状，早期贫血轻，后期贫血严重。晚期可出现血小板减少，引起出血症状。皮肤黏膜出血较多见，严重者可见内脏及颅内出血。 3.肝、脾、淋巴结和肾脏病变 肝、脾肿大，颈部淋巴结肿大，骨髓瘤肾。器官肿大或者异常肿物需要考虑髓外浆细胞瘤或者淀粉样变。 4.神经系统症状 神经系统髓外浆细胞瘤可出现肢体瘫痪、嗜睡、昏迷、复视、失明、视力减退。 5.多发性骨髓瘤多见细菌感染 亦可见真菌、病毒感染，最常见为细菌性肺炎、泌尿系感染、败血症，病毒性带状庖疹也容易发生，尤其是治疗后免疫低下的患者。 6.肾功能损害 50%～70%病人尿检有蛋白、红细胞、白细胞、管型，出现慢性肾功能衰竭、高磷酸血症、高钙血症、高尿酸血症，可形成尿酸结石。 7.高黏滞综合征 可发生头晕、眼花、视力障碍，并可突发晕厥、意识障碍。 8.淀粉样变 常发生于舌、皮肤、心脏、胃肠道等部位。 初始诊断检查 所有患者的初始诊断检查应包括病史、体检以及以下基线血液和生化检查，以便区分症状性和无症状性MM：完整的血细胞计数（CBC）（带分类计数和血小板计数）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐、血清电解质、血钙、白蛋白、乳酸脱氢酶（LDH）、β2微球蛋白。BUN和肌酐升高提示肾功能减退，而LDH水平有助于评估肿瘤细胞负荷。β2微球蛋白水平可反映肿块情况，现在被认为是评估肿瘤负荷的标准指标。 大部分患者存在血清蛋白，伴或不伴相关尿蛋白。 为评估骨髓浆细胞浸润情况，建议行骨髓穿刺检查或活检以定量和/或定性了解骨髓浆细胞异常情况。为评估溶骨性病变情况，建议行全面的骨骼影像学检查。 诊断分类 初步将患者分为冒烟型（无症状）骨髓瘤或活动性(有症状)骨髓瘤。 国际骨髓瘤工作组（IMWG）商定的冒烟型（无症状性）患者标准包括低浓度M蛋白（≥30g/L）和/或骨髓浆细胞浸润≥10%；但并无无贫血、肾功能衰竭、高钙血症或骨病变。 冒烟型（无症状性）骨髓瘤 冒烟型（无症状性）骨髓瘤为无症状及无器官或组织受损的病程阶段。Durie-SalmonI期骨髓瘤患者伴低M蛋白、无明显贫血、高钙血症及骨疾病，应属此类。无症状性冒烟型MM患者在未治疗情况下常呈慢性病程持续很多年。 有症状骨髓瘤 血/尿M蛋白：无血、尿M蛋白量的限制，大多数病例IgG>30g/L或IgA>25g/L或24h尿轻链>1g，但有些有症状MM患者低于此水平
杂交瘤细胞培养及其注意事项
杂交瘤细胞培养及其注意事项 单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用，包括细胞的培养、培养基的选择，融合时期的选择，从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养，促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。 标签：杂交瘤；细胞培养；单克隆抗体 随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用，杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善，但是国内实验室设备和条件有限，多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被，结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株，融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存，仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。 1杂交瘤的起源和生产 1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的新细胞系，称之为P3-X63-Ag8。由于X63本身分泌IgG1，形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外，同时分泌X63产生的抗体，因其抗体不纯，现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。国内现已引进NS-1，SP2/0，FO，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。 1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤，需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞，但融合率不高，还没有推广使用。目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。细胞生长缓慢，抗体分泌力弱及效价较低，且难于克隆化等困难[2]，限制了人骨髓瘤细胞的应用。 1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合，而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler，et al. 1977；Schwaber，1977）。脾脏是大量T或B细胞的来源，与小鼠骨髓瘤细胞融合时，最常用的是小鼠的脾细胞。按照Burnet的细胞系选择学说，一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，其”后代”也只能产生此种抗体，因为抗体是由DNA上的基因所决定，基因是可以遗传的。在正常情况下，小鼠脾中含有能产生各种不同抗体的B细胞，一只纯种小鼠体内可有（1～5）×107种不同的抗体，即有（1～5）×107种不同的B细胞。为了提高获得某种杂交瘤的机会，就需要设法增加小鼠体内分泌该种抗体的B细胞的数量。最常用的方法是用特定抗原多次免疫小鼠，使之产生特异性抗体。通过将免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的融合，然后经过多次筛选，从而得到特异性的杂交瘤细胞。这样所获得的特异性的杂交瘤细胞在既具有脾细胞分泌抗体的能力的同时，又具有小鼠骨髓瘤细胞永生的特性，从而可以无限制地提供
多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤 骨髓瘤即多发性骨髓瘤,或称浆细胞肉瘤本病由Rustizky于1873年首先描述其病理并定名为多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma),简称MM。MM属造血系统肿瘤,是浆细胞异常过度增生所至的恶性肿瘤。异常浆细胞即骨髓瘤细胞浸润骨髓及软组织,产生M球蛋白,引起骨骼破坏、贫血、肾功能损害和免疫功能异常等。近年来,多发性骨髓瘤发病有增高趋势。发病率为2～3/10万,发病年龄多见于中老年,以50~60岁之间为多,40岁以下者较少见。男性多于女性,男女比约为2:1。 一、病因 本病病因不详,可能与下列因素有关。 1.临床上有些慢性感染及炎症,如慢性骨髓炎、慢性肝炎、肾盂肾炎、结核等可伴有浆细胞恶性增生。这可能是由于抗原长期慢性刺激网状内皮系统的结果,同时也提出任何导致网状内皮系统受慢性刺激后可能引起骨髓瘤的发生的可能。 2.根据动物实验观察,发现本病可能直接因病毒感染而引起,长期病毒感染可表现为网状内皮系统增生。 3.由于多发性骨髓瘤的发病率在从事放射线工作者较一般人群为高,电离辐射被认为是发病原因之一。自1950年至1976年对日本原子弹爆炸后幸存者的研究表明,接受空气量100cGy后本病发病率是正常人的 4.7倍。 4.多发性骨髓瘤与某些遗传因素有关。染色体异常在隐匿型多发性骨髓瘤为0;新诊断的活动型为18%;进展型为63%;最常见的染色体异常为[t(11;14) q13;q32)]。 关于多发性骨髓瘤的起源存在不同的假说,其中较为公认的是肿瘤前体细胞学说。认为骨髓中TdT-、CALLA+的前B细胞受到某种抗原的刺激,发生增殖、恶变,中间不经过sIg+B细胞阶段直接分化为CALLA+的前浆细胞,由彰浆细胞发生克隆性扩增,分化为恶性浆细胞,形成骨髓瘤。另外CALLA+细胞可以进入外周血,引起骨髓瘤的播散,形成多发性病灶。外周血中正常分化的前B细胞向静止期B细胞转化的过程中受到抗原刺激,发生恶变,重新返回接种于骨髓内,转变为肿瘤前体细胞,发生多发性骨髓瘤。 二、多发性骨髓瘤细胞学 1.骨髓瘤细胞的细胞动力学 多发性骨髓瘤早期即临床前期,细胞增殖时间少于72h,约经过1~2年的时间,临床上才渐现骨髓瘤的表现。而当其临床表现明显时,瘤细胞增殖时间逐渐延长,约为4~6个月。当肿瘤增殖达一定容积时,骨髓瘤细胞数可保持在水平线上数月甚至数年,多发性骨髓瘤细胞属于终末细胞,需靠具有克隆扩增和分化能力的处于较早分化时期的恶变B细胞增殖分化而补充。此期谓之细胞稳定期。研究表明,如在细胞稳定期杀灭骨髓瘤细胞,同时增殖期瘤细胞也随之增加。因此,治疗过程中应用细胞周期非特异性药物的同时,要加用细胞周期特异性的药物才能取得较好的疗效。 2.骨髓瘤细胞的单克隆免疫球蛋白合成率。 骨髓瘤细胞有巨大免疫球蛋白(M蛋白)的合成能力,在2~4小时内所产生的M蛋白相当于细胞内所含的免疫球蛋白总量。研究推算得出:每个骨髓瘤细胞约含M蛋白500万~10000万分子,每个骨髓瘤细胞每天合成M蛋白为2.5~38Pg。
杂交瘤细胞的培养,保存和复苏
杂交瘤细胞培养冻存与复苏 杂交瘤细胞适用于无血清的培养基，无血清培养的基础培养基和添加物质杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。不同基础培养基对细胞的无血清培养有一定的影响。不同细胞系对基础培养基也有选择性。最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEM+F12,DMEM+F12+RPMI 1640。形成的无血清培养基常能支持杂交瘤细胞在分批培养中生长到1×106细胞/ml以上，最终的单抗浓度可达10 μg/ml~100 μg/ml。基本上你说的那两种都有可能，你可以参考以下操作： 【转贴】细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制 ①RPMI-1640基础培养液，1 000ml RPMI-1640粉 10.4g 丙酮酸钠 0.11g 用900ml三蒸水(或无离子水再经过双蒸)，通CO2搅拌溶解。称取1.8g NaHCO3，用少量三蒸水溶解，边搅拌边加入1640液中。补足1 000ml，通过0.22μm滤膜正压过滤除菌(用CO2钢瓶加压)，分装，置30℃，菌检48小时4℃存放。效期不超过三个月。 ②RPMI-1640完全培养液，100ml 双抗(青、链霉素) 0.1ml 3％L-谷氨酰胺 2.5ml 犊牛血清 15.0ml 1640基础培养液 81.5ml 用时现配，4℃下存放不超过一周，用于细胞融合和克隆化培养的全培养液，可将小牛血清增至20％。 ③200mmol/L(3％)L-谷氨酰胺溶液 L-谷氨酰胺 5.846g 三蒸水 200ml 加热至50℃使全溶，0.22μm膜滤除菌，按每管4ml分装，-20℃保存。 ④双抗溶液 青霉素(钠盐) 100万iu 链霉素(硫酸盐) 1g 溶于100ml灭菌三蒸水中，小量分装，-20℃冻存。 杂交瘤细胞的保存 当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免
临床血液学简答和名解
1、常用的一期、二期止血缺陷的筛选试验有哪些？ 答：一期止血缺陷的筛选试验包括出血时间、毛细血管抵抗力试验、血小板计数和血块收缩试验。二期止血缺陷的筛选试验包括全凝血时间、活化的部分凝血活酶时间及血浆凝血酶原时间。 2、述急性单核细胞白血病骨髓象特点。 答：原单及幼单细胞体积较大，形态变化多端。胞核较小，常偏于一侧，呈笔架形、马蹄形、S形、肾形或不规则形。胞浆相对较多，常出现内外双层胞质，有明显伪足突出，边缘清晰，外层清测，内层毛玻璃样。胞质内常有空泡和被吞噬的细胞。 3、简述骨髓穿刺检查的适应证。 答：①外周血细胞数量、成分及形态异常。②不明原因的发热,肝、脾、淋巴结肿大。③不明原因的骨疼，骨质破坏，肝、肾功能异常、紫癜、血沉明显增加。④恶性血液病化疗后疗效观察，⑤其它：骨髓活检、染色体核型分析、微生物及寄生虫学检查 4、简述大致正常骨髓象特点。 1)、有核细胞增生活跃2)、各系各阶段有核细胞所占百分比基本在正常参考值范围内3)、各种血细胞形态无明显异常4)、无寄生虫和明显异常细胞 5、MDS的FAB分型分哪几型？ 1)、难治性贫血（RA）2)、环形铁粒幼细胞难治性贫血（RAS）3)、原始细胞过多难治性贫血（RAEB）4)、转化中的原始细胞过多难治性贫血（RAEB－T）；5)、慢性粒－单核细胞白血病（CMML） 6、简述过氧化物酶染色的原理： 粒细胞和部分单核细胞内含有过氧化物酶，其能分解H2O2而放出新生态的氧,后者可使四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝,后者再与亚硝基铁氰化钠结合,进一步氧化为稳定的蓝色物质,沉淀于酶活性的细胞内. 7、简述急性白血病完全缓解的标准？ ①无临床症状和体征；②血象：Hb≥100g/L(女性90g/L),N ≥1.5×109/L,PLT ≥100 ×109/L，外周血中无白血病细胞。③骨髓象：原始＋幼稚细胞≤5％。 1、血小板的止血功能有哪些？ 1)、粘附功能2)、聚集功能 3)、释放反应4)、促凝作用5）、血块收缩 8、简述CML急变期诊断标准 CML具有下列之一可诊断本期：1)、外周血或骨髓中原始细胞或原淋+幼淋，或原单+幼单≥20% 2)、外周血中原始粒细胞+早幼粒细胞≥30%（RAS）3)、骨髓中原始粒细胞+早幼粒细胞≥50%4)、有髓外原始细胞浸润 9、诊断缺铁性贫血时，铁代谢检查包括哪些？各有何变化？ 答：血清铁降低，血清铁蛋白降低，血清总铁结合力增高，转铁蛋白饱和度降低＜15％，转铁蛋白增高，红细胞内游离原卟琳测定增高。 10,、什么是血小板的开放管道系统？其功能有哪些？ 答：是血小板膜凹陷于血小板内部形成的管道系统，是血小板内与血浆中物质交换的通道，在释放反应中血小板贮存颗粒内容物经此通道排至细胞外。 11、简述急性再障的血象与骨髓象特点 血象：全血细胞减少，网织红细胞绝对值降低， 骨髓象：造血细胞（粒、红、巨三系）明显减少，非造血细胞（淋巴细胞、浆细胞、肥大细胞、脂肪细胞）比例增高； 12、如何区别三种急性白血病（急淋，急粒，急单）的原始细胞。 ⑴原粒：圆或椭圆形，核染色质细颗粒状，如薄沙。胞质天蓝或深蓝色。 原淋：圆或椭圆形，核染色质颗粒状，胞质少，淡蓝色、透明近核处有一透明区。 原单：圆或不规则形，有扭、折，可有伪足，核不规则有扭、折或凹陷。胞质灰蓝色，不透明。⑵细胞组织化学染色：POX。 13、急性再生障碍性贫血的骨髓象有哪些主要表现。 答：造血细胞减少，非造血细胞增多。可出现纤维化或脂肪物。 14、骨髓铁染色的临床意义？ 答：主要用于缺铁性贫血和环形铁粒幼细胞性贫血的诊断。 1骨髓象检查的适应症有哪些？ 答：①不明原因的发热,肝脾、淋巴结肿大；②不明原因的骨疼，骨质破坏，肝、肾功能异常、紫癜、血沉增高；③恶性血液病化疗后疗效观察；④其它……⑤⑥⑦⑧ 15、简述急性早幼粒细胞白血病的诊断要点。 答：①符合急性白血病的诊断标准；②骨髓中以颗粒增多的早幼粒细胞为主，≥30%，③早幼粒：原幼粒＞3：1，④异常早幼粒细胞核大小不一，胞质中有大小不等的颗粒，可见Auer 小体；⑤过氧化物酶阳性；
实验一、骨髓瘤细胞的培养
实验一、骨髓瘤细胞的培养 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同 一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653 等。 骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640, DMEM培养基。小牛血清的浓度 一般在10?20%,细胞的最大密度不得超106/ ml, 一般扩大培养以1 : 2稀释传代，每2? 3天传代一次。细胞的倍增时间为16?20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴 壁生长,只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 二材料： 1. 试剂： （ 1 ）培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640 或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，具体配置方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（0.22um滤膜），分装，4 C保存。 不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml,100 X L.G.溶液1ml，双抗溶液1ml, 7.5% NaHCO溶液1-2ml , HEPES溶夜1ml。 不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g,超纯水或四蒸水980ml, NaHCO3.7g , 100X L.G. 溶液10ml，双抗溶液10ml , 7.5% NaHCO溶液1-2ml，用1N HCl调试pH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4C保存。 完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml，灭活小牛血清15-20ml ,用于骨髓瘤细胞SP2/0 和建株后杂交瘤细胞培养。 （2）小牛血清灭活：从-20 C冰箱取出小牛血清，室温自然融化，56C 30min即可充分灭活，分装小瓶（5ml/瓶）,-20 C冻存备用，尽量避免反复冻融。 （3）青、链霉素（双抗）溶液（100X ）取青霉素G （钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g或100万单位，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20 C 冻存。 2. 器材： 超净工作台、CQ恒温培养箱、普通冰箱、电子天平，药物天平、巴氏吸管、10ml吸管、100ml 细胞培养瓶、滴管、灭菌小瓶等 三方法： 细胞冻存及复苏 先用24 孔细胞培养板扩大骨髓瘤细胞或单克隆抗体细胞株, 当长满时, 再扩大到100ml 细胞瓶。当其处于对数生长期时，将细胞洗下，用细胞冻存液（含10% DMS0 40% FCS的DMEM培养基）将细胞悬浮，调配成1-3 X 106个/ml,每个细胞冻存管分装1ml，移至液氮罐口悬吊2小时或-70 C冰箱过夜，然后沉入液氮中。复苏时，从液氮中取出冻存管后迅速置入40C水浴中，在1min内融化，1500rpm离心5min,弃上清，用少量完全培养基轻轻悬浮细胞,移入24 孔板中培养。 四、细胞培养应注意事项 1. 细胞培养瓶、吸管：使用前要严格消毒,对于新购置或已经使用的玻璃器皿,一般先用先用0.1%
多发性骨髓瘤常见分子细胞遗传学异常及其意义
多发性骨髓瘤常见分子细胞遗传学异常及其意义多发性骨髓瘤是一种常见的浆细胞恶性肿瘤，重要的染色体与基因异常导 致疾病的进展，在多发性骨髓瘤中具有独立的预后判断价值。随着检测方法的更新及技术的进步，异常染色体与基因的检出率越来越高，主要包括13号染色体全部或部分缺失伴或不伴14q32/IGH的重排等染色体异常。异常染色体与基因的检测具有重要价值，可完善MM预后评估体系，指导临床个体化治疗并为新药开发提供新的靶点。 标签：多发性骨髓瘤；分子细胞遗传学；预后 1染色体数目异常 1.1超二倍体 MM患者超二倍体主要表现为1、3、7、9、11、13、15、17、18、19、21、22三体型[1]；另外，近年来国内也有人发现MM患者8号染色体三体，王晓炜等[2]应用荧光免疫表型和间期细胞遗传学（FICTION）技术对MM骨髓涂片进行8号染色体检测，9例MM患者中，发现8号染色体三体1例，这可能与应用FICTION技术提高了检测效率有一定关系。 1.2亚二倍体 MM患者亚二倍体主要表现为6、8、13、14、X、Y单体型为特征；其中13号染色体单体缺失及其部分缺失是目前研究较为广泛的染色体异常之一。 2染色体结构异常 2.113号染色体异常 13 号染色体部分或完全缺失是MM 最早发现的染色体异常，MM 中较常见，而且是MM预后及生存期预测的指标之一。13号染色体异常，特别是13单体（-13）和13号染色体长臂部分缺失（13q-）与MM预后的关系越来越受到重视。目前认为13号染色体上存在MM 抑癌基因，其缺失与疾病危重、疗效和预后密切相关。Pérez-Simón等[3]采用荧光原位杂交（FISH）方法分析了15 种不同染色体异常在常规剂量化疗患者中的预后价值，发现13号染色体缺失是最重要的预示生存期短的预后指标，但对治疗反应无影响。由于13q-的断裂点范围在13q11~13q14，RB1基因正好也于这个区域，因此有人推测13号染色体完全或部分缺失所致MM预后不良可能与RB1基因改变有关。 Chiecchio等[4]通过FISH技术对400例新发MM患者染色体检测发现，至少有一种染色体数目或结构异常者达99%，其中13号染色体缺失：单体缺失及部分缺失约占47%。Fonseca等[5]采用cig-FISH 技术在54%的MM患者中检测
生理学 第三章血液练习题及答案
第三章血液 试题精选 一、填空题 1.体液约占体重的① %,其中细胞内液约占体重的② %，细胞外液约占体重的③ %，血浆约体重的④ %。 2血装的渗透压大约与① %葡萄糖或② %氯化钠溶被相等，当血浆渗之 压明显降低时，进人红细胞内的水分③，致使红细胞④这种现象称为渗透性⑤。 3.用盐析法可将血浆蛋白分为①、②和③三大类。其中含量最多的是④它是构成血浆⑤渗透压的主要成分，⑥是防御功能的的重要组成部分，⑦则参与血液凝固。 4.正常人血家的PH值为①，成它取决于血浆中主要缓冲对②的比值，正常值为③。 5.造血过程可分为①阶段、②阶段和③阶段等三个阶段。 6.红细胞的功能是①和②。生成红细胞所需的原料主要有③、 ④、⑤和⑥。 7. 白细胞可分为①、②、③、④和⑤等五类。 8.正常成人血小板的数量是①，当血小板数减少到② _以下时，可出现紫癜。 9.参与凝血过程的物质称为①。按其被发现的先后顺序，以②统一命名。血液凝固的三个基本步骤是③、④和⑤。按始动凝血的因子来源的不同，凝血过程可分为⑥性凝血和⑦性凝血两条途径。 10. 体内的抗凝系统可分为①抗凝系统和②抗凝系统两类。 11. 纤溶系统包括四种成分，即①、②、③和④。 12. ABO血型系统将人类的血型分成①型、②型、③型和④ 型四种血型;Rh血型系统将人类的血型分成⑤和⑥两种血型。 二、选择题 [A型题] 1.机体细胞内液与组织液通常具有相同的（） A. [Na+] B. [K+] C. [Ca2+] D.胶体渗透压 E.总渗透压 2.用溶血标本测定血清中的离子浓度,其结果是（） A.血[K+ ]偏高 B.血[Na+ ]偏高 C.血[Ca2+ ]偏高 D.血[Cl- ]偏高 E.各种离子浓度变化不大 3. 血沉加快表示红细胞的（） A.膜通透性增大 B.脆性增大 C.脆性减小
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。 第一次筛选的原理和方法： 细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其一居室细胞中的DNA合成油两条途径： 一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HA T培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。 另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。 因此，在HA T培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3-4次，直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。第二次筛选也是鉴定的过程。
【标准与讨论】中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017年修订)
【标准与讨论】中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017年修订) 作者：中国医师协会血液科医师分会中华医学会血液学分会中国医师协会多发性骨髓瘤专业委员会本文刊于：中华内科杂志, 2017,56(11) : 866-870 多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种克隆性浆细胞异常增殖的恶性疾病，在很多国家是血液系统第2位常见恶性肿瘤，多发于老年，目前仍无法治愈。随着新药不断问世及检测手段的提高，MM的诊断和治疗得以不断改进和完善，每两年一次的中国MM诊治指南的更新对于提高我国MM 的诊治水平具有重要意义。 临床表现MM常见的症状包括骨髓瘤相关器官功能损伤的 表现，即'CRAB'症状[血钙增高(calcium elevation)，肾功能损害(renal insufficiency)，贫血(anemia)，骨病(bone disease)，详见诊断标准]，以及淀粉样变性等靶器官损害等相关表现。诊断标准、分型、分期一、诊断所需的检测项目(表1)[1,2]对于临床疑似MM的患者，针对MM疾病要完成基本检查项目的检测，有条件者可进行对诊断病情及预后分层具有重要价值的项目检测。 二、诊断标准参考美国国立综合癌症网络(NCCN)及国际骨髓瘤工作组(IMWG)的指南[3]，诊断无症状骨髓瘤(冒烟型骨髓瘤)和有症状骨髓瘤(活动性骨髓瘤)的标准见表2，表3。三、
分型依照异常增殖的免疫球蛋白类型分为：IgG型、IgA型、IgD型、IgM型、IgE型、轻链型、双克隆型以及不分泌型。进一步可根据轻链类型分为κ型和λ型。 四、分期按照传统的Durie-Salmon(DS)分期体系[4]和修订的国际分期体系(R-ISS)[5]进行分期(表4，表5)。 鉴别诊断MM需与可出现M蛋白的下列疾病鉴别：意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、华氏巨球蛋白血症(WM)、冒烟型WM及IgM型MGUS、AL型淀粉样变性、孤立性浆细胞瘤(骨或骨外)、POEMS综合征、反应性浆细胞增多症(RP)、浆母细胞性淋巴瘤(PBL)、单克隆免疫球蛋白相关肾损害(MGRS)[6]，骨损害需与转移性癌的溶骨性病变等鉴别。其中，MGRS是由于单克隆免疫球蛋白或其片段导致的肾脏损害，其血液学改变更接近MGUS，但出现肾功能损害，需要肾脏活检证明是M蛋白沉积等病变所致。MM的预后评估与危险分层MM在生物学及临床上都具有明显的 异质性，建议进行预后分层。MM的精准预后分层仍然在研究探索中[7,8]。 MM的预后因素主要可以归为宿主因素、肿瘤特征和治疗方式及对治疗的反应3个大类，单一因素常并不足以决定预后。宿主因素中，年龄、体能状态和老年人身心健康评估(geriatric assessment，GA)评分可用于评估预后。肿瘤因素中， Durie-Salmon分期主要反映肿瘤负荷与临床进程；R-ISS主
内科学血液系统习题选择题带答案
第5章 第1节 562. 血细胞来源于骨髓的： A、网织细胞 B、原血细胞 C、T细胞 D、B细胞 E、造血多能干细胞 563. 贫血的定义是指外周血液中： A、红细胞低于正常 B、红细胞压积低于正常 C、红细胞数及血红蛋白量低于正常 D、红细胞数、血红蛋白或红细胞压积低于正常 E、循环血容量较正常者减少 564. 造血系统包括： A、血液 B、骨髓 C、脾 D、淋巴结及全身各部位的淋巴和单核吞噬细胞系统 E、以上均是 565. 造血系统疾病的主要临床表现有： A、血细胞量和质的变化所引起的相应症状
B、肝脾淋巴结肿大 C、血浆成分发生病理性改变 D、以上均是 E、以上均不是 566. 血液患者应注意询问一下那种病史： A、营养障碍病史及职业情况 B、慢性疾病史及过敏史 C、家族史 D、月经史 E、以上均是 第2节 567. 试验结果为MCV＜80立方微米，MCHC＜30%符合下列哪种贫血： A、急性失血性贫血 B、营养性巨幼细胞性贫血 C、再生障碍性贫血 D、骨髓病性贫血 E、缺铁性贫血 568. 贫血按细胞形态学分为： A、小细胞低色素性贫血及大细胞性贫血 B、正常细胞性贫血及正常细胞性贫血 C、小细胞低色素性贫血及正常细胞性贫血
D、小细胞低色素性贫血，大细胞性贫血及正常细胞性贫血 E、只有正常细胞性贫血 569. 贫血按病因和发病机理分为： A、造血物质缺乏和红细胞破坏过多 B、骨髓造血功能障碍和造血物质缺乏 C、红细胞和血红蛋白生成减少，红细胞破坏过多及失血性贫血 D、失血性贫血和红细胞破坏过多 E、失血性贫血和骨髓造血功能障碍 570. 世界卫生组织诊断贫血的血红蛋白标准是： A、成年男性低于130g/L，成年女性低于120g/L，孕妇低于110g/L B、成年男性低于120g/L，成年女性低于130g/L，孕妇低于110g/L C、成年男性低于120g/L，成年女性低于120g/L，孕妇低于130g/L D、成年男性低于130g/L，成年女性低于110g/L，孕妇低于120g/L E、成年男性低于110g/L，成年女性低于120g/L，孕妇低于130g/L 571. 我国诊断贫血的血红蛋白标准是： A、成年男性低于120g/L，成年女性低于110g/L，孕妇低于100g/L B、成年男性低于110g/L，成年女性低于120g/L，孕妇低于110g/L C、成年男性低于120g/L，成年女性低于100g/L，孕妇低于110g/L D、成年男性低于130g/L，成年女性低于120g/L，孕妇低于100g/L E、成年男性低于130g/L，成年女性低于110g/L，孕妇低于100g/L 572. 贫血患者治疗应首选： A、药物治疗
内科学(第七版)造血系统疾病第十一章 多发性骨髓瘤
第十一章多发性骨髓瘤 多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是浆细胞的恶性肿瘤。骨髓瘤绌胞在骨髓内克隆性增殖，引起溶骨性骨骼破坏；骨髓瘤细胞分泌单株免疫球蛋白，正常的多株免疫球蛋白合成受抑，本周蛋白随尿液排出；常伴有贫血，肾衰竭和骨髓瘤细胞髓外浸润所致的各种损害。我国MM发病率约为1／10万，低于西方工业发达国家(约4／10万)。发病年龄大多在50～60岁之间，40岁以下者较少见，男女之比为3：2。 【病因和发病机制】 病因不明。有学者认为人类8型疱疹病毒(human herpesvirus-8，HHV-8)参与了MM的发生。骨髓瘤细胞起源于B记忆细胞或幼浆细胞。细胞因子白介素-6(IL-6)是促进B细胞分化成浆细胞的调节因子。进展性MM患者骨髓中IL-6异常升高，提示以IL-6为中心的细胞因子网络失调导致骨髓瘤细胞增生。 【病理生理和临床表现】 (一)骨髓瘤细胞对骨骼和其他组织器官的浸润与破坏 1．骨骼破坏骨髓瘤细胞在骨髓中增生，刺激由基质细胞衍变而来的成骨细胞过度表达IL-6，激活破骨细胞，导致骨质疏松及溶骨性破坏。 骨痛为常见症状，随病情发展而加重。疼痛部位多在骶部，其次为胸廓和肢体。活动或扭伤后剧痛者有自发性骨折的可能，多发生在肋骨、锁骨、下胸椎和上腰椎。多处肋骨或脊柱骨折可引起胸廓或脊柱畸形。骨髓瘤细胞浸润引起胸、肋、锁骨连接处发生串珠样结节者为本病的特征之一，如浸润骨髓可引起骨髓病性贫血。单个骨骼损害称为孤立性骨髓瘤。 2．髓外浸润①器官肿大如淋巴结、肾和肝脾肿大。②神经损害胸、腰椎破坏压迫脊髓所致截瘫较常见，其次为神经根受累。脑神经瘫痪较少见。多发性神经病变，呈双侧对称性远端感觉和运动障碍。如同时有多发性神经病变、
血液学
造血器官：能够生成并支持造血细胞分化、发育、成熟的组织器官称为造血器官。人类造血器官起源于中胚层的原始间叶细胞。 MDS(骨髓增生异常综合征)：是一组克隆性造血干细胞疾病，以髓系中一系或多系血细胞减少或发育异常、无效造血以及急性髓系白血病发病风险增高为特征。 外源凝血途径：是指参与凝血的因子不完全来自血液中，部分由组织中进入血液。组织因子由各种途径进入血液，TF进入血液后并启动凝血。 血管内溶血：由红细胞内在缺陷或外在因素所致，红细胞在血管内被直接破坏，血红蛋白进入血浆，临床以血红蛋白血症和血红蛋白尿为主要特征，获得性多见。 血涂片检验的重要性（两者关系）：1、骨髓象相似而血象有区别：如溶血性贫血、缺铁性贫血和急性失血的骨髓象相似，但血象有区别；2、骨髓象有区别而血象相似：如传染性淋巴细胞增多症和慢性淋巴细胞白血病的血象中皆有小淋巴细胞增多，但前者骨髓中淋巴细胞稍增多，而后者骨髓中淋巴细胞却明细增多；3、骨髓象变化不显著而血象有显著异常：如传染性单核细胞增多症，其骨髓中的异性淋巴细胞少见，而血象中异型淋巴细胞常大于20%；4、骨髓象有显著异常而血象变化不显著：如多发性骨髓瘤、戈谢病、尼曼—匹克病，其骨髓中分别可见到特异性的骨髓瘤细胞、戈谢细胞、尼曼—匹克细胞，但血象中甚少见到； 5、血象中细胞较骨髓中细胞成熟：血象中血细胞来源于骨髓，因此白血病时血象中的白血病细胞较骨髓中成熟、轻易辨认，故结合血象可辅助诊断白血病细胞类型的判断。 G6PD缺陷症分型及实验室检查特点：1、临床分型：蚕豆病、急性溶血性贫血、新生儿高胆红素血症、先天性非球形红细胞性溶血性贫血。2、G6PD筛选试验：高铁血红蛋白还原试验、变形珠蛋白小体生成试验，中度异常测量G6PD活性降低，但溶血高峰期及恢复期活性可接近正常，故应离心去除衰老红细胞再进行测定，并定期复查。 急性早幼粒细胞白血病临床特点及实验室检查特点:1、临床特点：除发热、感染、贫血、浸润等急性白血病症状外，广泛而严重的出血为本病特点。以皮肤黏膜最明显，其次为消化道、泌尿道等，颅内出血最严重，为致死原因之一。2、检查特点：急性早幼粒细胞白血病，骨髓中异常早幼粒细胞≥ 30%（NEC），胞质内有大量密集甚至融合的粗大颗粒，常有成束的棒状小体。M3v为变异型急性早幼粒细胞白血病，胞质内颗粒较小或无。 微环境：由骨髓基质细胞、微血管、神经和基质细胞分泌的细胞因子等组成，是造血干细胞生存的场所，对造血干细胞的自我更新、定向分化、增殖及造血细胞增殖、分化、成熟调控起重要作用。 Moto cell(桑葚细胞、莫托细胞)：形成地图样、葡萄状细胞。这些小球体称为russell小体，为球蛋白聚集产物，少时称ressell小体，多时称moto cell。通常为病例细胞，如MM。 骨髓活检适应证：1骨髓穿刺失败骨髓穿刺多次失败，临床怀疑骨髓纤维化、骨髓转移癌、多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病、某些急、慢性白血病及骨髓硬化症等。2．全血细胞减少; 血象显示全血细胞减少，反复骨髓穿刺均为“血稀”或骨髓增生低下，病态造血，怀疑再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征及低增生性白血病的患者。3．特殊贫血; 某些贫血原因不明的发热、脾或淋巴结肿大、骨髓涂片检查不能确诊者。4．白血病治疗疗效的观察; 临床上有时骨髓涂片已达到完全缓解，但骨髓活检切片内仍可检出白血病性原始细胞簇，因此，在白血病的缓解后化疗及长期无病生存期间，应定期作骨髓双标本取材。倘若骨髓涂片未达复发标准，而切片内出现了异常原始细胞簇，提示已进入早期复发，应及时对症治疗 ALIP(幼稚细胞异常定位)：原始\早幼粒细胞3~5个远离肾小梁聚集在一起，常见于MDS。热点现象：同一成熟阶段的幼稚红细胞所组成的细胞岛，多见于MDS。 高铁血红蛋白：正常人Hb含耳夹铁离子，与氧结合为氧合Hb，当Hb中铁丧失一个电子，被氧化为三价铁离子时，称为高铁Hb。失去运氧功能，且不稳定，易形成珠蛋白小体。正常人搞铁Hb仅占Hb汗了1%。
杂交瘤细胞的复苏与冻存
杂交瘤细胞的复苏与冻存 一． 杂交瘤细胞的复苏 杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。 通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。 不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。 二 杂交瘤细胞的冻存 细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃- -20℃，每分钟下降1℃；-20℃--40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。下面的细胞冻存方法，细胞复苏存活率均在80%以上。 1.材料： 带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布； 含10-20%血清、5-10% DMSO 的HT 培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）；灭菌安瓶或带盖小瓶；-70℃冰箱；液氮及液氮罐；处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。 方法：复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。用5-10ml HT 培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT 培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml 小鼠腹腔细胞进行培养。 2、方法： （1）. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml ，分装安瓶，每瓶1ml ，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。 （2）安瓶封口后仍置冰浴上。 （3）将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。 （4）2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。 （5）液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜
多发性骨髓瘤
第二十章多发性骨髓瘤 概述： 多发性骨髓瘤是一种主要侵及骨髓，导致骨质破坏的恶性浆细胞肿瘤。国内的流行病学统计资料较少，在欧美的发病率为2－4/10万，（近年来发病率有逐年增高的趋势）。好发于老年人，40岁以下约占2%，男女比例为1.6－3.0：1。 疗效短暂，现有治疗手段难以达到治愈。近年来随着新药出现，以及造血干细胞移植和移植后的维持治疗延长了疾病控制和生存，改善了生活质量。 第一节诊断： 一、临床特征： （一）区域性表现： 1.骨痛：呈游走性或间歇性，常由活动引起。病情进展 转为持续性剧烈疼痛：（其 2.骨骼肿块、病理性骨折：局部肿块多见于胸骨、肋骨、 颅骨、锁骨等扁状骨。病理性骨折多见于胸椎下段和 腰椎上段、肋骨、锁骨等部位。 3.髓外器官受侵：肝、脾、淋巴结多见。 4.
5.神经系统病变。 （二）全身性表现： 1. 2.贫血：（为正细胞正色素性贫血，少数合并白细胞 3.反复感染：为本病最主要死亡原因。肺部感染最常 见。多为革兰氏阴性杆菌。此外化脓性感染、泌尿系 感染、带状疱疹亦可出现。 4. （写症状） 5.淀粉样变：可引起舌肥大、心脏扩大、外周神经病变和皮肤苔藓样变。 二、辅助检查： （一）影像学检查： 1. X线检查的表现： ⑴溶骨性改变, 骨质缺损，如头颅可见典型圆形穿凿样溶骨性改变； ⑵弥漫性骨质疏松； ⑶骨质疏松基础上合并病理性骨折，多见于肋骨、腰椎等； ⑷骨硬化极少见，多为局限性改变。 2. MRI：用于脊髓压迫患者或可疑孤立性骨浆细胞瘤患者的
检查。 3. CT：可发现早期病变，也可用于髓外浆细胞瘤评估。（二）实验室检查: 1. 白细胞计数多数正常，分类应注意有无浆细胞，若>20%或绝对值>2×109/L即为浆细胞白血病。 2. 血沉：多数增快。 3. 血钙测定：10%～30%患者出现血钙增高。 4. 高尿酸血症: 大量瘤细胞分解引起，肾功能损害时更为显著。 5. 血清β2微球蛋白（β2—MG）：增高的水平与肿瘤的活动 程度成正比，与疾病的预后、疗效及病情进展有关。6.血清蛋白电泳和免疫球蛋白测定： 蛋白电泳球蛋白区可见窄底高峰的单株Ig(即M蛋白)，系因某种Ig呈单株性增高而其它Ig合成受抑，水平低于正常所致。免疫电泳可确定异常Ig的种类和含量，如IgG、IgA、IgD、IgE、IgM 及轻链κ或λ型。偶有双株型或非分泌型。 7.尿本－周蛋白：约90%患者尿浓缩法可查出阳性。 三、多发性骨髓瘤的组织学类型： 浆细胞骨髓瘤 非分泌型骨髓瘤