EB病毒感染实验室诊断方法探讨[1]
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
与 V CA IgM 检测方法相比, FQ PCR 检测到 EBV 感染 的阳性 率更高, EBV DNA 的 定量检 测可帮 助诊断 儿科 活动性 EBV 感 染, 尤其是可疑患儿的临床诊断。
关键词: EB病毒; 酶联 免疫吸附试验; 荧光定量聚合酶链反应
Analysis of laboratory assays app lied for d iagnosis of Ep stein B arr viru s SU L iyun, X U J in, SUN J iae, D ING Yunzhen. P ed ia tric Institute, Children s'H o sp ital, Fudan University, Shanghai 200032, China
材料和方法
一、材料 1. 标本来源 2004年 3月 ~ 12 月, 采集本 院住院患儿外周血, 共 70例, 依据临床 EBV 感染 诊断标准 [ 2] 分组, 其中 17例确诊为 EBV 感染及
作者简介: 苏犁云, 女, 1973年生, 技师, 主要从事临床病毒学检验工作。
514
检验医学 2006年第 21卷第 5 期 Laboratory M ed icin e 2006, V ol 21. N o 5.
AGTCGGAGCGGTTAAACAT 3,' P2 5 'GGCCATCG CAAGCTCCTT 3, '探 针 5 'F am TCTGGCAGCACCG GCCACAC T am ra 3。'
二、方法
1. 血清 EBV VCA IgM 检测 采用 EL ISA, 按 试剂盒操作说明进行。
2. EBV DNA 检测 取外周血 1 m ,l 肝素抗 凝, 淋巴细胞分离液分离单个核细胞, 加入等体积 T ris EDTA裂解液和蛋白酶 K, 37 ! 水浴 1 h, 高 速离心后取上清, 经酚 氯仿抽提, 乙醇沉淀清洗 得到 DNA 模板 [ 3] 。将 EBV 的标准株 B95 8, 按上 述核酸抽提程序, 得到 EBV DNA 模板。用普通 PCR 扩 增仪 扩增, 反应 体系 为: P1 P2 引 物 0. 2
传染性单核细胞增多症患儿 (确诊组 ) , 27例临床 高度怀疑 EBV 感染患儿 (疑似组 ), 26 例临床非 EBV 感染患儿 ( 对照组 )。
2. 主要试剂 EL ISA 试剂盒 ( 购自美国 D i agnostic autom ation公司 ); 淋巴细胞分离液 ( 购自 上海华 美公 司 ) ; T ris 碱、琼脂 糖、蛋 白 酶 K、及 UN IQ 10DNA胶回收试剂盒 ( 均购自上海生工生 物公司 ) ; 引物、T aqm an探针 ( 由上海生工生物公 司合成 ) ; 热启动 酶 ( 购自上 海 AB I公司 ); 普通 T aq酶 (购自北京天为时代公司 )。
图 1 EBV 的定量标准曲线
表 1 FQ PCR 检测 EBV DNA 与 EL ISA 检测 V CA IgM 结 果比较
组别 例数 EL ISA VCA IgM
确诊组 17 阳性 阴性
疑似组 27 阳性 阴性
对照组 26 阳性 阴性
总计
EBV DNA 阴性 合计 阳性
17
0 17
0
0
0
7
0
7
15
K ey word s: Epste in Ba rr v irus; Enzym e liked imm unosorbent assay; FFra Baidu bibliotekluorescence quantitative po lym erase cha in reaction
EB 病 毒 ( Epste in Barr virus, EBV ) 属 疱疹病 毒科, 为线形双链 DNA 病毒, 人类是 EBV 惟一天 然宿主。 EBV 在口咽部上皮细胞内增殖, 然后感 染 B 淋巴细胞。据报道, 我国 95% 以上人群在 3 ~ 5岁时已感染了 EBV [ 1 ] 。这些被感染的 B淋巴 细胞大量进入血液循环而造成全身性感染, 并可 长期潜伏在人体淋巴组织中, 当机体免疫功能低 下时, 潜伏的 EBV 活化形成复发感染。 EBV 主要 引起传染性单核细胞增多 症和非洲儿童 淋巴瘤 ( 即 Burkitt淋巴瘤 ) , 并与许多涉及造血和神经系 统的临床疾病密切相关。
3. 主要仪器 AB I 7000全自动 FQ PCR 仪, 1601 UV 分光光度仪。
4. 标准株 EBV原型株 B95 8( 购自中科院 细胞库 ) 。
5. 引物与探针 根据 B95 8 立刻早期基因 BZLF1序列分析设计引物和特异性探针, 扩增片 段长度为 101 bp。引 物 及探 针 的 序列: P1 5 '
异有显著性 ( P < 0. 05)。
结果
一、3组患儿临床特征和其他实验室指标 17 例确 诊 组 患 儿 中 确 诊 传 染 性 单 核 细 胞 增 多症 4例, EBV 感染 13 例。在入院前后均有发 热, 淋巴结和 /或扁桃体肿大, 13例周围血象中异 型淋巴细胞 > 10% , 4例淋巴细胞百分比升高, 16 例 CD4 /CD8比例倒置。 27 例疑似组, 均有不规 则发热, 部分患儿淋巴结肿大, 肝功能异常, 临床 除其他诊断外高度怀疑患儿伴有 EBV 感染。阴 性对照组 26例, 临床无 EBV 感染症状, VCA IgM 阴性, 未怀疑有 EBV 感染。 二、EBV 的定量标准曲线 以 EBV 的起始拷贝数的自然对数为横坐标, 以循环阈值 ( ct) 为纵坐标, 可得到一条严格的直 线型标准曲线, 斜率为 - 3. 95, 线性相关系数 ( r) > 0. 99, 最低可检测到 103 拷贝, 见图 1。
摘要: 目的 探讨 EB病毒 ( EBV ) 感染的实验室诊断方法。方法 设计针对 EBV 基因组的引物和荧光 标记 探针, 利用实时荧光定量聚合酶链反应 ( FQ PCR )检测 70例外周血标 本。其中 17 例是确诊 EBV 感染及传 染性 单核细胞增多症患儿, 27例是临床高度怀疑 EBV 感染 患儿, 26例是 临床非 EBV 感染 的患儿, 并 与检测 EBV 抗 体 VCA IgM 的酶联免疫吸附试验 ( EL ISA )进行比较。结果 确诊组、疑似组和对照组患儿 FQ PCR 检测 EBV 的 阳性率分别为 100. 00% 、81. 48% 和 0. 00% 。与此对应 V CA IgM 的阳 性率分 别为 100. 00% 、25. 93% 和 0. 00% 。 确诊组 EBV DNA 的平均拷贝数为 1. 15 105 /m ,l 疑似组为 4. 38 104 /m ,l 均明显高 于对照组 ( P < 0. 05) 。结论
Abstract: O b jec tive To analyze labo ra tory assays fo r diagnosis o f Epste in Barr virus( EBV ). M ethods Pr im ers and probesw ere designed to identify genome of EBV and 70 sam plesw ere analyzed by fluorescence quantitative po lym er ase cha in reaction ( FQ PCR ). These samp les include 17 ch ildren w ith diagnosed EBV infec tion and ( or) infectious m ononucleosis, 27 w ith high ly suspected EBV infection and 26 w ithout EBV infection. T he resu lts w ere compared w ith tha t of EBV VCA IgM de tected by enzym e linked immunoso rbent assay ( EL ISA ). R esults Positive rates o f FQ PCR for three g roups w ere 100. 00% , 81. 48% and 0. 00% respective ly and positive ra tes o f VCA IgM we re 100. 00% , 25. 93% and 0. 00% respectively. T he m ean v irus DNA copies o f d iagnosed group w ere significantly h igher than tha t o f neg ative control group (P < 0. 05), wh ich w ere 1. 15 105 /m ,l 4. 38 104 /m l respec tive ly. Conclusions Po sitive ra te of EBV infection determ ined by the assay o f FQ PCR is higher than that by EBV VCA IgM. Quantification of EBV DNA could be he lpful for d iagno sis of c linical EBV infection espec ia lly fo r those patients w ith suspec ted EBV in fection.
EBV 分离培养困难, 临床一般用血清学方法
和分子生物学方法辅助诊断。目前较多实验室采 用酶联免疫吸附试验 ( EL ISA ) 或免疫荧光技术检 测血清中特异性 EBV 抗体, 但检出率较低且只能 定性。本研究建立荧光定量聚合酶 链反应 ( FQ PCR) 检测 EBV DNA 的方法, 并与血清抗体作比 较, 旨在探讨 EBV感染实验室诊断方法的特点。
m o l/L, dNTP 100 m o l/L, T aq酶 1. 25 U , 总体 积 50 。l 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳后, 纯化回 收扩增片段, 得到标准品, 测吸光度 ( A ) 值, 计算 出相应 的拷贝数, 稀释成 108、107、106、105、104、 103 拷贝浓度梯度, 置 AB I 7000 扩增。反应体系 为: P1、P2 引 物 0. 2 m o l/L, 探 针 0. 2 m ol /L, dNT P 100 m o l/L, M g2+ 25 m o l/L, 热 启 动 酶 1. 25 U, 总体积 50 。l 反应条件为 95 ! 20 m in, 95 ! 30 s, 60 ! 1 m in, 40个循环。反应结束, 经 电脑处理得到标准曲线。
5 20
0
0
0
0
0 26
39
31 70
三、EBV DNA 与 VCA IgM 检测结果的比较 确诊组 17 例, FQ PCR 检测均为 阳性, 阳性
检验医学 2006 年第 21卷第 5 期 Laboratory M ed icin e 2006, V ol 21. N o 5.
采用与标准品相同的反应体系和反应条件, 在 AB I 7000上同时扩增标本 DNA 和不同稀释度 的标准品, 外周血 标本中 DNA 的 拷贝数自 动显 示。将结果定义为每毫升 外周血单个核 细胞的
EBV DNA 拷贝数, 每毫升 > 104 拷贝为阳性。 三、统计学方法 采用 SPSS10. 5 进行 M ann W h itney 统计, 差
检验医学 2006 年第 21卷第 5 期 Laboratory M ed icin e 2006, V ol 21. N o 5.
513
文章编号: 1001 2087 ( 2006) 05 0513 04
中图分类号: R 373
文献标识码: A
EB病毒感染实验室诊断方法探讨
苏犁云, 徐 锦, 孙家娥, 丁韵珍 ( 复旦大学附属儿科医院儿科研究所病毒室, 上海 200032)
关键词: EB病毒; 酶联 免疫吸附试验; 荧光定量聚合酶链反应
Analysis of laboratory assays app lied for d iagnosis of Ep stein B arr viru s SU L iyun, X U J in, SUN J iae, D ING Yunzhen. P ed ia tric Institute, Children s'H o sp ital, Fudan University, Shanghai 200032, China
材料和方法
一、材料 1. 标本来源 2004年 3月 ~ 12 月, 采集本 院住院患儿外周血, 共 70例, 依据临床 EBV 感染 诊断标准 [ 2] 分组, 其中 17例确诊为 EBV 感染及
作者简介: 苏犁云, 女, 1973年生, 技师, 主要从事临床病毒学检验工作。
514
检验医学 2006年第 21卷第 5 期 Laboratory M ed icin e 2006, V ol 21. N o 5.
AGTCGGAGCGGTTAAACAT 3,' P2 5 'GGCCATCG CAAGCTCCTT 3, '探 针 5 'F am TCTGGCAGCACCG GCCACAC T am ra 3。'
二、方法
1. 血清 EBV VCA IgM 检测 采用 EL ISA, 按 试剂盒操作说明进行。
2. EBV DNA 检测 取外周血 1 m ,l 肝素抗 凝, 淋巴细胞分离液分离单个核细胞, 加入等体积 T ris EDTA裂解液和蛋白酶 K, 37 ! 水浴 1 h, 高 速离心后取上清, 经酚 氯仿抽提, 乙醇沉淀清洗 得到 DNA 模板 [ 3] 。将 EBV 的标准株 B95 8, 按上 述核酸抽提程序, 得到 EBV DNA 模板。用普通 PCR 扩 增仪 扩增, 反应 体系 为: P1 P2 引 物 0. 2
传染性单核细胞增多症患儿 (确诊组 ) , 27例临床 高度怀疑 EBV 感染患儿 (疑似组 ), 26 例临床非 EBV 感染患儿 ( 对照组 )。
2. 主要试剂 EL ISA 试剂盒 ( 购自美国 D i agnostic autom ation公司 ); 淋巴细胞分离液 ( 购自 上海华 美公 司 ) ; T ris 碱、琼脂 糖、蛋 白 酶 K、及 UN IQ 10DNA胶回收试剂盒 ( 均购自上海生工生 物公司 ) ; 引物、T aqm an探针 ( 由上海生工生物公 司合成 ) ; 热启动 酶 ( 购自上 海 AB I公司 ); 普通 T aq酶 (购自北京天为时代公司 )。
图 1 EBV 的定量标准曲线
表 1 FQ PCR 检测 EBV DNA 与 EL ISA 检测 V CA IgM 结 果比较
组别 例数 EL ISA VCA IgM
确诊组 17 阳性 阴性
疑似组 27 阳性 阴性
对照组 26 阳性 阴性
总计
EBV DNA 阴性 合计 阳性
17
0 17
0
0
0
7
0
7
15
K ey word s: Epste in Ba rr v irus; Enzym e liked imm unosorbent assay; FFra Baidu bibliotekluorescence quantitative po lym erase cha in reaction
EB 病 毒 ( Epste in Barr virus, EBV ) 属 疱疹病 毒科, 为线形双链 DNA 病毒, 人类是 EBV 惟一天 然宿主。 EBV 在口咽部上皮细胞内增殖, 然后感 染 B 淋巴细胞。据报道, 我国 95% 以上人群在 3 ~ 5岁时已感染了 EBV [ 1 ] 。这些被感染的 B淋巴 细胞大量进入血液循环而造成全身性感染, 并可 长期潜伏在人体淋巴组织中, 当机体免疫功能低 下时, 潜伏的 EBV 活化形成复发感染。 EBV 主要 引起传染性单核细胞增多 症和非洲儿童 淋巴瘤 ( 即 Burkitt淋巴瘤 ) , 并与许多涉及造血和神经系 统的临床疾病密切相关。
3. 主要仪器 AB I 7000全自动 FQ PCR 仪, 1601 UV 分光光度仪。
4. 标准株 EBV原型株 B95 8( 购自中科院 细胞库 ) 。
5. 引物与探针 根据 B95 8 立刻早期基因 BZLF1序列分析设计引物和特异性探针, 扩增片 段长度为 101 bp。引 物 及探 针 的 序列: P1 5 '
异有显著性 ( P < 0. 05)。
结果
一、3组患儿临床特征和其他实验室指标 17 例确 诊 组 患 儿 中 确 诊 传 染 性 单 核 细 胞 增 多症 4例, EBV 感染 13 例。在入院前后均有发 热, 淋巴结和 /或扁桃体肿大, 13例周围血象中异 型淋巴细胞 > 10% , 4例淋巴细胞百分比升高, 16 例 CD4 /CD8比例倒置。 27 例疑似组, 均有不规 则发热, 部分患儿淋巴结肿大, 肝功能异常, 临床 除其他诊断外高度怀疑患儿伴有 EBV 感染。阴 性对照组 26例, 临床无 EBV 感染症状, VCA IgM 阴性, 未怀疑有 EBV 感染。 二、EBV 的定量标准曲线 以 EBV 的起始拷贝数的自然对数为横坐标, 以循环阈值 ( ct) 为纵坐标, 可得到一条严格的直 线型标准曲线, 斜率为 - 3. 95, 线性相关系数 ( r) > 0. 99, 最低可检测到 103 拷贝, 见图 1。
摘要: 目的 探讨 EB病毒 ( EBV ) 感染的实验室诊断方法。方法 设计针对 EBV 基因组的引物和荧光 标记 探针, 利用实时荧光定量聚合酶链反应 ( FQ PCR )检测 70例外周血标 本。其中 17 例是确诊 EBV 感染及传 染性 单核细胞增多症患儿, 27例是临床高度怀疑 EBV 感染 患儿, 26例是 临床非 EBV 感染 的患儿, 并 与检测 EBV 抗 体 VCA IgM 的酶联免疫吸附试验 ( EL ISA )进行比较。结果 确诊组、疑似组和对照组患儿 FQ PCR 检测 EBV 的 阳性率分别为 100. 00% 、81. 48% 和 0. 00% 。与此对应 V CA IgM 的阳 性率分 别为 100. 00% 、25. 93% 和 0. 00% 。 确诊组 EBV DNA 的平均拷贝数为 1. 15 105 /m ,l 疑似组为 4. 38 104 /m ,l 均明显高 于对照组 ( P < 0. 05) 。结论
Abstract: O b jec tive To analyze labo ra tory assays fo r diagnosis o f Epste in Barr virus( EBV ). M ethods Pr im ers and probesw ere designed to identify genome of EBV and 70 sam plesw ere analyzed by fluorescence quantitative po lym er ase cha in reaction ( FQ PCR ). These samp les include 17 ch ildren w ith diagnosed EBV infec tion and ( or) infectious m ononucleosis, 27 w ith high ly suspected EBV infection and 26 w ithout EBV infection. T he resu lts w ere compared w ith tha t of EBV VCA IgM de tected by enzym e linked immunoso rbent assay ( EL ISA ). R esults Positive rates o f FQ PCR for three g roups w ere 100. 00% , 81. 48% and 0. 00% respective ly and positive ra tes o f VCA IgM we re 100. 00% , 25. 93% and 0. 00% respectively. T he m ean v irus DNA copies o f d iagnosed group w ere significantly h igher than tha t o f neg ative control group (P < 0. 05), wh ich w ere 1. 15 105 /m ,l 4. 38 104 /m l respec tive ly. Conclusions Po sitive ra te of EBV infection determ ined by the assay o f FQ PCR is higher than that by EBV VCA IgM. Quantification of EBV DNA could be he lpful for d iagno sis of c linical EBV infection espec ia lly fo r those patients w ith suspec ted EBV in fection.
EBV 分离培养困难, 临床一般用血清学方法
和分子生物学方法辅助诊断。目前较多实验室采 用酶联免疫吸附试验 ( EL ISA ) 或免疫荧光技术检 测血清中特异性 EBV 抗体, 但检出率较低且只能 定性。本研究建立荧光定量聚合酶 链反应 ( FQ PCR) 检测 EBV DNA 的方法, 并与血清抗体作比 较, 旨在探讨 EBV感染实验室诊断方法的特点。
m o l/L, dNTP 100 m o l/L, T aq酶 1. 25 U , 总体 积 50 。l 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳后, 纯化回 收扩增片段, 得到标准品, 测吸光度 ( A ) 值, 计算 出相应 的拷贝数, 稀释成 108、107、106、105、104、 103 拷贝浓度梯度, 置 AB I 7000 扩增。反应体系 为: P1、P2 引 物 0. 2 m o l/L, 探 针 0. 2 m ol /L, dNT P 100 m o l/L, M g2+ 25 m o l/L, 热 启 动 酶 1. 25 U, 总体积 50 。l 反应条件为 95 ! 20 m in, 95 ! 30 s, 60 ! 1 m in, 40个循环。反应结束, 经 电脑处理得到标准曲线。
5 20
0
0
0
0
0 26
39
31 70
三、EBV DNA 与 VCA IgM 检测结果的比较 确诊组 17 例, FQ PCR 检测均为 阳性, 阳性
检验医学 2006 年第 21卷第 5 期 Laboratory M ed icin e 2006, V ol 21. N o 5.
采用与标准品相同的反应体系和反应条件, 在 AB I 7000上同时扩增标本 DNA 和不同稀释度 的标准品, 外周血 标本中 DNA 的 拷贝数自 动显 示。将结果定义为每毫升 外周血单个核 细胞的
EBV DNA 拷贝数, 每毫升 > 104 拷贝为阳性。 三、统计学方法 采用 SPSS10. 5 进行 M ann W h itney 统计, 差
检验医学 2006 年第 21卷第 5 期 Laboratory M ed icin e 2006, V ol 21. N o 5.
513
文章编号: 1001 2087 ( 2006) 05 0513 04
中图分类号: R 373
文献标识码: A
EB病毒感染实验室诊断方法探讨
苏犁云, 徐 锦, 孙家娥, 丁韵珍 ( 复旦大学附属儿科医院儿科研究所病毒室, 上海 200032)