单细胞凝胶电泳的原理及特点

单细胞凝胶电泳的原理及特点

单细胞凝胶电泳分析（single cell gel eletrophoresis，SCGE）是由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，能够灵敏地检测DNA断裂，在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。因其细胞电泳形态颇似彗星，又称彗星实验（comet assay）。有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载波片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，但核DNA仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上，并留在原位。如果细胞未受损伤，电泳时，核DNA因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形的荧光团，无脱尾现象。若细胞受损，在中性电泳液（pH=8）中，核DNA 仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液（pH>13）中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。细胞DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强，因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞DNA损伤的程度。SCGE检测单细胞水平DNA损伤，无须放射性示踪，适用于各种有核细胞，样品用量少，试验周期短，故而灵敏、快速、高效。

SCGE检测原理：

一般认为，在通常情况下，DNA双链以组蛋白为核心盘旋形成核小体，在核小体中DNA 位负超螺旋结构，如果有去污剂进入细胞，核蛋白被浓盐提取，DNA便形成残留的类核，如果；类核中DNA断裂，就会在核外形成一个DNA晕轮，DNA断裂将引起超螺旋松散，电泳时DNA片段向阳性伸展，形成特征性彗星尾，这时彗星尾可能还与头部有秩序的结构以单链相连。

在中性电泳液中，核DNA仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂时，其断片方进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。而在碱性电泳液中，DNA双链解螺旋变性为单链，单链断裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断裂或碎片离开核DNA向阳性迁移，形成拖尾。细胞DNA受损愈重，产生断裂或键易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强，因此，通过测定DNA迁移部分的吸光度或迁移长度可定量的测定单个细胞DNA损伤的程度。