琼脂扩散

3.主要实验仪器及材料 恒温培养箱，微量加样器，琼脂糖，1%硫 柳汞，鸡传染性法氏囊病琼扩抗原和鸡传 染性法氏囊病参考阳性血清。 0.1mol/L、pH7.2PBS，生理盐水。 4.掌握要点 琼脂糖凝胶板的制备；打孔和加样；待检 血清的稀释；结果判定和分析。
5.实验方法 （1）1.2%琼脂糖凝胶板的制备 称取1.2g优质琼脂糖，8g氯化钠，加120ml 蒸馏水，在微波炉中加热，使之完全溶化， 待水蒸发到100ml刻度处时停止加热。加 1ml 1%硫柳汞，混匀，分装，直径Fra Baidu bibliotekcm的平 皿加9ml，冷却。
（2）用打孔器按适当间距打孔，如下图， 每组中心1孔加周围6孔，在酒精灯上烘 烤封底。在微量反应板上加生理盐水或 0.1mol/L、pH7.2PBS，对待检血清进行 倍比稀释。加样，周围5孔加倍比稀释的 待检血清，第6孔加鸡传染性法氏囊病参 考阳性血清，中心孔加鸡传染性法氏囊 病琼扩抗原，均加满。
当扩散到它们的浓度比例相适宜的部位时， 抗原和相对应的抗体形成大的抗原-抗体复 合物，出现一条乳白色沉淀线。如果抗原 和抗体不相对应，或者抗原与对应抗体之 间浓度比例相差太大，无沉淀线出现。 该试验可用已知抗原检测未知抗体，或已 知抗体检测未知抗原，可用于分析复杂的 抗原成分，测定抗原和抗体的纯度，测定 抗体效价和抗原滴度，可以用于分析两种 抗原成分的差异性。
实验二
双向双扩散试验
1.目的和要求 通过本次实验，可了解双向琼脂扩散试验 的原理和用途，掌握沉淀抗体效价的测定 方法，观察抗原和抗体在琼脂凝胶中形成 的沉淀线。
2.原理 10g/L琼脂糖凝胶呈多孔结构，孔径大约 80nm，各种抗原、抗体分子可以在里面自 由扩散。在琼脂糖凝胶板上，相距适当距 离打小孔，小孔内分别加适量的抗原和抗 体。将抗原液和抗体液分别加入同一琼脂 糖凝胶板内的相邻小孔中，抗原和抗体分 子在凝胶中顺浓度梯度自由扩散。
（3）置于湿盒，放在恒温培养箱中，37℃、 24h-48h。判定依据，周围1-5孔与中心孔之间出 现沉淀线，且与第6孔与中心孔形成的沉淀线发 生融合，结果为阳性，以最高稀释度的孔为反应 滴度。见图片。 6、注意事项 （1）琼脂凝胶的厚度及孔间距要适当，否则， 结果会受影响。 （2）最好选用优质琼脂糖，制备的凝胶更透明。