链霉素耐药细菌的分离及鉴定

链霉素耐药细菌的分离及鉴定

摘要：本实验对江和河道水源中链霉素耐药细菌的分离及鉴定，判断水体的链霉素污染情况。实验先通过含链霉素及不含链霉素的LB固体培养基培养、计数、筛选有耐药性的细菌，再采用连续梯度稀释法纯化、16S rDNA扩增法进行分子鉴定，完成对耐药菌初步鉴定。实验结论对预防和减缓水源耐药性细菌问题，为以后耐药性机制的研究及寻找新型抗生素积累菌种资源有重要意义。

关键词：链霉素耐药细菌分离鉴定

链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，属于氨基糖甙碱性化合物，分子式C21H39N7O12。链霉素能与30s亚基结合并影响蛋白质合成的多个环节从而起到杀菌的作用。其结构为一分子链霉素胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷。链霉素为白色无定形粉末，在酸性条件下可以水解成链霉胍和链霉双糖胺，进一步水解可得到N-甲基-L-葡萄糖胺。在弱碱性情况下也可以水解得到链霉胍和链霉双糖胺，但进一步水解即将链霉糖部分重排为麦芽酚，麦芽酚可以跟Fe3+反应生成紫红色配合物，这是链霉素的特有反应，可用于其鉴别，亦可用作含量测定。链霉素分子中还有醛基，可以被氧化剂氧化而降低抗菌活性。

细菌耐药性也称细菌抗药性，是指细菌能抵御抗生素影响的能力。细菌耐药性按传统的分类方法分为固有耐药性和获得耐药性。固

有耐药性也叫做天然耐药性，是细菌对抗菌药的天然不敏感，由于具有这种特点的细菌不具有药物的作用靶点而产生耐药性。获得耐药性是细菌在长期接触抗菌药物情况下发生变异，从而获得耐药性。这种耐药性包括交叉耐药性、单向耐药性和多重耐药性。细菌获得耐药性发生的机制可分为遗传学机制和生化机制。

目前由于大量地使用链霉素，导致链霉素在一些食品和生物体中有残留。含链霉素废水排入天然水体中，是链霉素的存在于自然环境中的关键原因。链霉素的残留又是导致耐药细菌产生的重要原因，所以必须对环境、农产品和食品中链霉素残留量进行检测，避免链霉素通过食物链在某一生物体内积累。

1 材料和方法

1.1材料

1.1．1 耗材离心管（1.5ml）、PCR 扩增管（0.2ml）、枪头（10μl、200μl、1ml）、1.5ml离心管盒、45mm过滤器、0.25μm 滤膜等。

1.1.2 仪器和试剂移夜枪、pH计、培养箱、H1650电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）、高速离心离心机、PCR仪（PTC100，MJ 公司）

蛋白胨、酵母浸膏、链霉素（Genview）、16S rDNA引物（F27、

R1492，上海英骏生物技术有限公司）、Taq酶（上海申能博彩）等

2 方法

2.1 预处理培养皿、试管、移液枪枪头、过滤器等的灭菌；LB 培养的配制；链霉素（1.6 mg/ml）的配制；抗生素平板的制备，将灭好菌的装有50ml LB固体培养基的三角瓶放入60℃水浴锅中，在水浴锅中保温半小时，使培养基的温度不超过50℃，然后取出三角瓶，加入链霉素（0.8 mg/ml）225μl，摇匀，于无菌台上倒平板，每个平板所加的培养基约为15ml，平板倒好冷却后，立即放入避光环境下。37℃培养箱中放置过夜。

2.2 耐药性菌株的筛选

从R1河流及R2河流中取得水样，取200μl水样涂布在含抗生素的平板上，另将原水样稀释成10-1和10-2，分别取100μl涂布在不含抗生素的平板上作对照，平衡涂布3个平板，置于37℃培养箱中培养24h。第二天观察并计录单菌落数，同时计算细菌的耐药率。并从含抗生素平板上挑取菌落比较特殊的单菌落进行下一步的纯化鉴定。

2.3 耐药性细菌菌株的纯化及保藏

对所挑取的耐药性细菌菌株采用梯度稀释法进行纯化。用无菌的

接种环将挑取的单菌落接到含有0.5ml LB液体培养基的1.5ml离心管中，振荡混匀后，作为原液，然后进行10倍的稀释至10-4和10-5，取这两个稀释度的悬浮液100μl涂布在固体培养基上，置于37℃培养箱中培养24h。重复三次。培养得到单菌落，对单菌落进行观察并记录菌落形态和大小，并接种到3ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床中，200rpm，振荡培养24h。取无菌的1.5ml离心管于离心管盒中，在管盖上标上抗生素、菌株编号和日期。用200μl移液枪吸取200μl 50%甘油到1.5ml离心管中，再加入800μl上述菌液到离心管中，颠倒混匀，于-20℃冰箱中保存。

2.4 耐药性细菌菌株的MIC测定

配制链霉素浓度梯度的LB液体培养基：0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml，分别接种10μl上述纯化得到的细菌的菌液，于37℃摇床中，200rpm，振荡培养24h，第二天观察细菌生长情况，以在试管内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。

2.5 革兰氏染色

革兰氏染色及镜检涂片干燥、加热固定冷却结晶紫初染、碘液媒染酒精脱色番红复染、干燥镜检。

2.6 16S rDNA序列扩增及分析

2.6.1 将上述得到的纯种接种至LB液体培养基中培养过夜，取100μl菌液至无菌1.5ml离心管中，以10000rpm离心2min，用枪吸去上清夜；加入100μl的无菌水，振荡重悬菌体，于100℃水浴锅中煮10min以破壁，冷却至室温后以12000rpm离心2min，吸取50μl 上清夜至另一个无菌的离心管中作为16S rDNA扩增的DNA模板。采用细菌16S rDNA通用引物F27（5´- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3´）及R1492（5´- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3´），按以下反应体系进行PCR：PCR 程序：

94℃，3 min

94℃，45 sec

58℃，45 sec

72℃，90 sec，30 cycles

72℃，10 min

10℃，10min

10×PCR buffer5μl

dNTPs4μl

F27 引物（10pmol/μl）2μl