免疫亲和色谱

分离过程概述
当含有待测物的样品粗提液经过免疫亲和柱时，粗 提液中对抗体有特殊亲和力的待测物就会结合到抗 体上，通过淋洗去除非目标分析物后，再采用适当 的方法将结合在抗体的目标物洗脱下来，从而使被 测物选择性的提取和浓缩。
免疫亲和色谱的特点

选择性，专属性强 因为IAC是利用抗原抗体的特异性反应，所以 只有与色谱固定相抗原决定簇相吻合的被测物才 能被结合。 可通过制备高纯度的抗体以及有多个活性位点 的抗体来尽可能地提高抗原的选择性和专属性。
亲和色谱
免疫亲和层析则是以抗体为配基的一种亲和色谱。 利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免 疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的 有效手段。

平衡液
混合蛋白 样品
含配体溶液
带有配体的树 脂珠或胶粒
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
免疫亲和色谱的原理
利用抗原与抗体的高亲和力、高专一性和可结 合的特点以及色谱技术的差速迁移理论而建立的一 种新型色谱技术。 就是将被测物的特异性抗体固定在适当的固相载 体上，制备成免疫亲和色谱的固定相（免疫亲和色 谱柱），根据被测物的反应原性、抗原抗体结合的 特异性记忆，抗原抗体复合物在一定条件下能够可 逆解离的特性进行色谱分离。

农药残留的检测 兽药残留的检测 真菌毒素的检测
主要用于样品粗提液的净化与浓缩
激素类药物和β2-受体激动剂 国标法测牛乳中的黄曲霉毒素
乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 GB 5413.37-2010
第二法
免疫亲和层析净化高效液相色谱法 原理：亲和柱内含有黄曲霉毒素M1特异性单 克隆抗体教练在固体支持物上，当试样通过 亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉毒素M1 （抗原）键合，形成抗体-抗原复合物。用水 洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂吸附在柱 上的黄曲霉毒素M1，收集洗脱液。用带荧光 检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中的黄 曲霉毒素M1含量。
仪器和设备 真空系统 带刻度的磨口锥形玻璃试管 水浴锅 高效液相色谱 滤纸 紫外分光光度计（200nm-400nm） 离心机 天平（0.01g） 容量瓶（100ml） 玻璃烧杯（250ml） 移液管（1.0ml、2.0ml、50.0ml） 一次性注射器（10ml和50ml）

乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 GB 5413.37-2010
乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 GB 5413.37-2010
试剂和材料 免疫亲和柱：最大容量不小于100ng黄曲霉毒素 M1（相当于50ml浓度为2ug/L） 柱效检查，回收率检查 乙腈(色谱纯） 氮气 三氯甲烷 黄曲霉毒素M1标准溶液（纯度≥98%）

乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 GB 5413.37-2010
目标蛋白质
抗体制备
介质制备
上样与洗脱

单抗制备复杂，成本高，但也具有很多优点。
色谱介质制备： 将抗体通过化学方法结合在色谱介质上 抗体之间交联形成不溶性衍生物


单抗问世后, 不少生物技术公司在研制适宜于培养杂交瘤 细胞不断完善, 将降低免疫亲和色谱吸附剂的价格。 随着新的合成基质和偶联化合物的出现以及对免疫亲和色 谱研究的深入, 必将使免疫亲和色谱在工业性生产纯化蛋 白质的应用上逐渐得到发展。
影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完 成破坏。 2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下， 亲和作用减弱或完成破坏。 3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用 4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是， 疏水性相互作用增强 5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱 6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失
免疫亲和色谱的特点
纯化、浓集效果好 本方法灵敏度高，分析时间短，分析效率高。 但有一定的仪器费用支出。 既可作为样品的制备技术，也可作为样品的分 离手段，还可用于样品的浓缩纯化。

免疫亲和色谱的特点

可循环（再生）使用 与传统的固相萃取技术相比，免疫亲和柱可 在适当的缓冲液冲洗后再生重复使用。
免疫亲和色谱过程


利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分 离的技术为亲和分离技术 亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用 的物质 亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用生物大分 子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建 立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特 异性亲和色谱。
解吸

特异性解吸——半抗原置换 非特异性解吸——调节pH值、加入试剂破坏氢键、引入 离子对、加入表面活性剂、冷蒸馏水洗涤。

应用
在食品科学领域的应用 在医药科学领域的应用 在色谱环境科学中的应用
在物质检测领域的应用
免疫亲和技术在食品领域的应用
实际检测中常与HPLC、质谱、荧光分光方 法联合使用
免疫亲和柱技术及其在黄曲霉等 检测中的应用
免疫亲和色谱
Immunoaffinity Chromatography,IAC
一种高效、简便的样品前处理技术，大大简化了提取、净化、 衍生化等复杂的前处理过程，在食品分析中属于痕量检测， 检测线非常低（达10-12数量级）。
概述


生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择 性地与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性 相互作用称为亲和作用。 生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素受体等亲和作用。

乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定
色谱分析 根据样品洗脱液色谱图中黄曲霉毒素M1的峰高或峰 面积值高于标准曲线范围，用水定容稀释样品洗脱 液后，重新进行分析。

分析结果与表示
分析步骤（避光操作） 1.样品制备（以牛乳为例） 水浴35-37摄氏度，离心7000转/分钟离心15分钟 ，样品量至少50ml。

乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定
免疫亲和柱的准备 将50ml注射器与亲和柱顶部相连，再将亲和柱与真 空系统连接起来。

乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定
试样的提取与纯化 移液管移取50ml试样到注射器，调节真空系统控制 试样以2ml/min-3ml/min 稳定的流速过柱。 取下50ml注射器，装上10ml注射器并加入10ml水 ，以稳定的流速洗柱，然后抽干亲和柱。 脱干真空系统，装上另一个10ml注射器，加入4ml 乙腈，缓缓推动注射器控制流速，洗脱黄曲霉毒素 M1，洗脱液收集在锥形管中，洗脱时间不少于60s 。用和缓的氮气在30摄氏度下将洗脱液蒸发至体积 为50ul-500ul（注意不要蒸干），再用水稀释10 倍至最终体积记为V1.

乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定
高效液相色谱分析 色谱条件： 色谱柱：C18，长25cm，内径4.6cm 流动相：25%乙腈水溶液 流速：1ml/min

乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定
高效液相色谱分析 标准曲线的绘制 根据高效液相色谱仪进样环容积，选择适当进样体 积数，分别注入含有0.05ng、0.1ng、0.2ng和 0.4ng的黄曲霉毒素M1标准溶液。 绘制成峰面积或峰高对黄曲霉毒素M1质量的标准曲 线。