明胶酶谱法

1%明胶（1g 明胶-->100ml ，37°水浴溶解） 0.5ml

酶谱法的基本过程是先将样品进行 SDS 聚丙烯酰胺（SDS-PAGE

含0.1 %明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使 样品中的

MMP-2和MMP-9t 复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明 胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色 条带，条带的强弱与 MMP-2和MMP-9舌性成正比。

复性原理：在电泳过程中,SDS 与样品中的MMP 結合（当然是可逆性结合）， 破坏其氢键、疏水键而使 MMP 不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置

Trition 中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min /次，做2次或15min/次，4次。

静置于Trition 中是不妥的。）时，由于SDS 被Trition 结合而去除，从而使

MMP 恢复了活性。

试剂的配制

（1）配制10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶 （含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低 灵敏度高）

A .分离胶的配制 （注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量） 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶 10ml （包括） ddH 20

30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）

TEMED

明胶酶谱法 原理:

4.5ml

2ml

1.5mol/l Tris (PH 8.8)

2.5ml 10% SDS 100ul

10%过硫酸铵（APS ）

100ul 8ul

50mmol/LTris ，pH7.5，150mmol/LNaCl ，10mmol/LCaCl2，0.02%NaN3 (孵育 42

小

时)

B.浓缩胶的配制 浓缩胶 6ml ddH2O 4.5ml 30%储备胶 0.75ml

1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml 10% SDS 60ul 10%过硫酸铵 60ul TEMED 6ul

(3) 5XTris 书氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL ，1.25mol/l 甘氨酸， 0.5%SDS (PH 8.3) (4) 4 ＞上样缓冲液 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS (PH7.2 ) 8ml 16%甘油 3.2 ml 溴酚蓝 0.024g ddH 2O 2.4ml

(5) 洗脱液 :2.5% Triton X-100 ，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L> ，

pH7. 6 (40 分钟两次，中间换液 ) 6) 漂洗液： 50mmol/L Tris-HCl ， 5mmol/L CaCl2 ，pH7. 6 (20 分钟 2次)

8) 染色液：

0.05% Coomassic 亮蓝 R-250 ， 30%甲醇， 10%乙酸( 染色 3 小时 )

9) 脱色液 A 、B 、C :甲醇浓度分别为 30%、20%、10 %，乙酸浓度分别为 10 %、10 %、

5%

分别 30min 、 1h 、 2h 脱色 )

孵育液：

实验步骤

1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基

DMEM 中培养 24h 。

2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中

2000rpm 离心10min , -70C 储存备用。

3. 根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度

总量一致）。与5心样缓冲液混合，13ul 样本+4ul 上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防 止出现过多气泡）

4. 配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量）， SDS-PAGE 电泳 100v 约 1.5 小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。

5. 电泳结束后 ,将凝胶置于洗脱液 (2.5% Triton X-100 ， 50mmol/L Tris -HCl ， 5mmol/L CaCl2 ， pH7. 6） 中振荡洗脱 2次,每次 40分钟 ,然后用漂洗液 （除不含 Triton X - 100 外其余同洗脱液 ） 漂洗 2次,每次 20分钟,接着,将凝胶置于孵育液 ( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中 37C 孵育 42h 。

6.孵育结束后经染色液（0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸）染色3h,及脱色液 A 、 B 、C （甲醇浓度分别为 30%、20%、10 %，乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%）分别脱色0.5、 1、2h 后，显示出 MMP-2（ 72KD ）和MMP-9 （ 92 KD ）为位于蓝色背景上的透亮带，用 凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

注意事项：

1. 制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡

。

2. 明胶酶谱的活性受钙离子， 锌离子， 和 PH 值等因素的影响， 因此缓冲液 配制应严格准确，

尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3. 用大梳子

4. 孵育液的 PH 最好在 7.5-7.6，复性的 TRITON 时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用 新鲜

配置的。

5. 孵育的 37度不要在 CO2 培养箱中，因为会改变孵育液的 PH 值，在普通孵箱即可。

6.明胶要 4度保存，配好后 1 周内使用

或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白

4 C 进行

凝胶制备:

1.玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧, 加满水检漏。

2.配10%分离胶，APS和TEMED 作用为促凝，最后灌胶前加。若板不漏水，则将水倒出, 并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。

3. 配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。

4.将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插

入，注意保持水平，约30min后凝固可用。

5.拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻

孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。

明胶酶谱分析法

默认分类2007-09-17 18:53:31 阅读2459评论6 字号：大中小订阅

1. 细胞培养或者提取组织

2. 试剂的配制

（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含 1.0mg/ml明胶）

A .分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）

10% SDS聚丙烯酰胺凝胶5ml （包括）

ddH2o 1.5ml

30% 储备胶（0.8%BIS+29.2% 丙烯酰胺） 1.65ml

1.5mol/l Tris （PH 8.8） 1.25ml

10% SDS 50ul

10%过硫酸铵50ul

TEMED 4ul

1% 明胶0.5ml

B.浓缩胶的配制

浓缩胶3ml

ddH2o 2.1ml

30%储备胶0.5ml