第二章--细胞破碎与提取要点
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1.组织捣碎机： 适用：动植物组织 2.匀浆器 适用：较柔软、易分散的组织细胞 3.研钵 适用：微生物（细菌）与植物细胞
㈡ 物理法
1．超声波破碎
2．渗透压冲击法：适用：处理胞壁较脆弱的微生物。
细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外 渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或 将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞 外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂
适用：细菌及病毒中对热不太敏感的物质
㈢．化学法
1． 溶剂处理法： 丙酮、氯仿、甲苯等
溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。
2． 表面活性剂法
破坏细胞膜，释放目的物（需与其它方法结合应用）。
（四）酶解法
1． 自溶法
保温一定时间，通过细胞本身的酶将细胞破坏。
2． 外加酶法
将细胞壁分解，使内含物释放出来。 细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA） 酵母：采用β-葡聚糖酶 霉菌：添加几丁质酶 植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了 崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪 元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物 时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌 为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、 人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人 γ－干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且 在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒－包 涵体（inclusion bodies IBs)。
注意动物的 年龄与性别
微生物生长 的对数期
植物采收 具有季节性
二、原料的预处理：
动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、
脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。
植物原料：要择时采集并就地去除不用的的部分，
有用部分保鲜处理。
微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。
三、原料的保存方法
（1）冷冻法：适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。 （2）有机溶剂脱水法：丙酮，该法适用于原料少而价值高、
第二章 蛋白质的制备 ---细胞破碎与萃取
第一节 蛋白质制备总则
一、目标：高效率、高收率、高纯度、高活性
二、方法选择依据： 根据不同蛋白质的性质和研究目的
1、蛋白质的性质：
来源、 胞内（胞外）、 可溶性、 分子大小、 等电点、 稳定性（对温度、pH、蛋白酶、金属离子的耐受性）等
2、研究目的：
考虑产品的质量、数量和经济性 越到后面的纯化越困难，增加成本，延长操作时间，收率低
粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 纯化(层析、电泳)
浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
首先：
材料的选择和预处理 细胞的破碎和细胞组分分离 有效成分的萃取
第二节 材料的选择、预处理与保存
一、原料选择原则： ➢有效成分含量高、原料来源丰富，易得； ➢原料中杂质含量少； ➢原料成本低等；
3．反复冻融法：-15℃～-20℃， 适用：动物材料
将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或 40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰 粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方 法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜 采用此法。
4．急热骤冷法： 85～90℃数分钟，冰浴冷却
有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。
（3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原
料，如发酵液、提取液等。
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 细胞破碎
一、破碎方法的原则和依据
原则：最大提取、不易变性、减少干扰
具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。
1、材料细胞的特性
动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法 植物细胞有细胞壁难破碎，须用中等或强度大的方法 微生物细胞较复杂，一般用较强的方法
包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表 达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为 此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离 包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢 复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅 增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为 生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机 理研究提出了新的课题。
2、目的物的特性
⑴．细胞中的位置 游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。 结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎
⑵．敏感性 温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响
⑶. 处理量 有些处理量大，如组织捣碎机等。 有些处理量少，如超声波破碎等。
二、破碎方法
㈠ 机械法
原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞 具体方法：
三、包含体及其纯化
例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累
包涵体（inclusion bodies），或包含体，是无定 形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破 碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以 沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐 酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的 蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被 破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键 不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质 可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠 过程称为蛋白质的复性。
2、包含体的构成
包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。
基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误 的，所以没有生物活性。
分离包含体后，需使目标蛋白恢复应有的天然活性。 （蛋白质折叠）
工业化应用：经济性（高收率，纯度次要） 一般研究：80%-90%纯度 结构研究：95%以上纯度 医疗：全面分析
三、确立有效成分的测定方法
1、蛋白质初步提取和浓缩
吸附法 超滤法 沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀） 透析
三、确立有效成分的测定方法
2、蛋白质高效分离纯化
色谱法（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等） 电泳法
（聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）
3、根据蛋白质性质确立分离方法
溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析 电荷不同：电泳，离子交换 分子形状大小不同：离心，透析，凝胶过滤
四、蛋白质的制备流程： 原料液
细胞分离(离心，过滤)
细胞－胞内产物 清液－胞外产物
细胞破碎
包含体
碎片分离
溶解(加盐酸胍、脲) 复性
㈡ 物理法
1．超声波破碎
2．渗透压冲击法：适用：处理胞壁较脆弱的微生物。
细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外 渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或 将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞 外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂
适用：细菌及病毒中对热不太敏感的物质
㈢．化学法
1． 溶剂处理法： 丙酮、氯仿、甲苯等
溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。
2． 表面活性剂法
破坏细胞膜，释放目的物（需与其它方法结合应用）。
（四）酶解法
1． 自溶法
保温一定时间，通过细胞本身的酶将细胞破坏。
2． 外加酶法
将细胞壁分解，使内含物释放出来。 细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA） 酵母：采用β-葡聚糖酶 霉菌：添加几丁质酶 植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了 崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪 元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物 时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌 为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、 人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人 γ－干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且 在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒－包 涵体（inclusion bodies IBs)。
注意动物的 年龄与性别
微生物生长 的对数期
植物采收 具有季节性
二、原料的预处理：
动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、
脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。
植物原料：要择时采集并就地去除不用的的部分，
有用部分保鲜处理。
微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。
三、原料的保存方法
（1）冷冻法：适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。 （2）有机溶剂脱水法：丙酮，该法适用于原料少而价值高、
第二章 蛋白质的制备 ---细胞破碎与萃取
第一节 蛋白质制备总则
一、目标：高效率、高收率、高纯度、高活性
二、方法选择依据： 根据不同蛋白质的性质和研究目的
1、蛋白质的性质：
来源、 胞内（胞外）、 可溶性、 分子大小、 等电点、 稳定性（对温度、pH、蛋白酶、金属离子的耐受性）等
2、研究目的：
考虑产品的质量、数量和经济性 越到后面的纯化越困难，增加成本，延长操作时间，收率低
粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 纯化(层析、电泳)
浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
首先：
材料的选择和预处理 细胞的破碎和细胞组分分离 有效成分的萃取
第二节 材料的选择、预处理与保存
一、原料选择原则： ➢有效成分含量高、原料来源丰富，易得； ➢原料中杂质含量少； ➢原料成本低等；
3．反复冻融法：-15℃～-20℃， 适用：动物材料
将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或 40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰 粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方 法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜 采用此法。
4．急热骤冷法： 85～90℃数分钟，冰浴冷却
有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。
（3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原
料，如发酵液、提取液等。
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 细胞破碎
一、破碎方法的原则和依据
原则：最大提取、不易变性、减少干扰
具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。
1、材料细胞的特性
动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法 植物细胞有细胞壁难破碎，须用中等或强度大的方法 微生物细胞较复杂，一般用较强的方法
包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表 达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为 此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离 包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢 复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅 增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为 生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机 理研究提出了新的课题。
2、目的物的特性
⑴．细胞中的位置 游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。 结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎
⑵．敏感性 温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响
⑶. 处理量 有些处理量大，如组织捣碎机等。 有些处理量少，如超声波破碎等。
二、破碎方法
㈠ 机械法
原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞 具体方法：
三、包含体及其纯化
例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累
包涵体（inclusion bodies），或包含体，是无定 形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破 碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以 沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐 酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的 蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被 破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键 不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质 可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠 过程称为蛋白质的复性。
2、包含体的构成
包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。
基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误 的，所以没有生物活性。
分离包含体后，需使目标蛋白恢复应有的天然活性。 （蛋白质折叠）
工业化应用：经济性（高收率，纯度次要） 一般研究：80%-90%纯度 结构研究：95%以上纯度 医疗：全面分析
三、确立有效成分的测定方法
1、蛋白质初步提取和浓缩
吸附法 超滤法 沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀） 透析
三、确立有效成分的测定方法
2、蛋白质高效分离纯化
色谱法（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等） 电泳法
（聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）
3、根据蛋白质性质确立分离方法
溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析 电荷不同：电泳，离子交换 分子形状大小不同：离心，透析，凝胶过滤
四、蛋白质的制备流程： 原料液
细胞分离(离心，过滤)
细胞－胞内产物 清液－胞外产物
细胞破碎
包含体
碎片分离
溶解(加盐酸胍、脲) 复性