实验十三包合物的制备及其验证

实验十六包合物的制备及其验证
一．实验目的
1．掌握饱和水溶液法制备包合物的工艺。

2．掌握包合物形成的验证方法。

二．实验指导
包合技术系指一种分子被包嵌于另一种分子的空穴结构内，形成包合物（inclusion compound）的技术。

这种包合物是由主分子（host molecule）和客分子（guest molecule）两种组分加合组成，主分子具有较大的空穴结构，足以将客分子容纳在内，形成分子囊（molecule capsule）。

目前，常用包合物的主分子以环糊精（CYD）为最多。

环糊精系淀粉用嗜碱性芽孢杆菌经培养得到的环糊精葡聚糖转位酶（Cyclodextrin glucanotransferase）作用后所形成的产物。

是由6~10个D-葡萄糖分子以1，4-糖苷键连接面成的环状低聚糖化合物。

环糊精为水溶性、非还原性的白色结晶性粉末。

常见的有α-、β-、γ-CYD 三种，分别由6，7，8个葡萄糖分子构成。

药物作为客分子经包合后，溶解度增大，稳定性提高，液体药物可粉末化，可防止挥发性成分挥发，掩盖药物的不良气味或味道，调节释药速率，提高药物的生物利用度，降低药物的刺激性与毒副作用等。

符合下列条件之一的有机药物，通常都可以与环糊精包合成包合物：药物结构中的原子数大于5个且药物的稠环小于5个；药物分子量在100~400之间；药物在水中的溶解度小于10mg/ml；药物的熔点低于250℃。

也有药物符合上述条件而不能与环糊精包合的，如几何形状不合适；也有因环糊精用量不合适而不能包合的。

无机药物大多数不宜与环糊精包合。

环糊精包合物的制备方法很多，有饱和水溶液法、研磨法、喷雾干燥法、冷冻干燥法以及中和法等，其中以饱和水溶液法（亦称重结晶法或共沉淀法）为最常用。

包合物根据主分子的构成可分为多分子包合物、单分子包合物和大分子包合物；根据主分子形成空穴的几何形状又分为管形包合物（channel或tunnel inclusion compound）、笼形包合物（chathrate或cage inclusion compound）和层状包合物（layer
inclusion compound）。

本实验的客分子为莪术挥发油，具有较强的挥发性，临床证明具有抗肿瘤作用。

莪术醇是莪术油中抗癌有效成分。

现有莪术油静脉注射液及乳剂等剂型，但稳定性较差，对光敏感，强光下易分解。

将莪术油制成包合物后，可减少莪术油的挥发，使液态油状态改变成固体粉末，便于配方，还可具有缓释作用。

三、实验内容与操作
（一）莪术挥发油-β环糊精包合物的制备
1．莪术挥发油的制备
将莪术粉碎成中等粉末，取200g，加入10倍量的蒸馏水，经挥发油提取器提取3.0小时，得棕褐色油状液体，用无水硫酸钠脱水后，即得莪术挥发油，备用。

2．莪术挥发油乙醇溶液的制备
精密吸取莪术挥发油1ml，加无水乙醇5ml，溶解，即得，备用。

3．β-环糊精饱和水溶液的制备
称取β-环糊精8g，置烧杯中，加蒸馏水100ml，在60±1℃条件下制成饱和水溶液，保温，备用。

4．莪术挥发油-β环糊精包合物的制备
将β-环糊精饱和水溶液100ml置烧杯中，于磁力搅拌器上，60℃恒温，另精密吸取莪术油乙醇液5ml，缓慢滴入到60℃的β-环糊精饱和水溶液中，不断搅拌，并用5ml无水乙醇洗涤移液管，同时将洗涤液滴入到β-环糊精饱和溶液中。

待出现浑浊逐渐有白色沉淀析出，继续搅拌4小时（本实验中为掌握方法，可暂定搅拌1小时），停止加热，继续搅拌至室温，最后置冰箱中放置12小时（实验中也可用冰浴冷却），待沉淀析出完全后，抽滤，用无水乙醇5ml洗涤三次，抽滤至干，50℃以下干燥，称重，计算收得率。

（二）包合物形成的验证方法
1．薄层色谱法（TLC）
⑴硅胶G板的制作
将1份固定相（硅胶G）和3份含有0.5%CMC-Na的水溶液在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动斜面器进行涂布（厚度为0.2~0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，然后在
110℃活化30分钟，取出后立即置有干燥剂的干燥箱中备用。

使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。

⑵ 样品液的制备
① 莪术挥发油样品液的制备（A ）
精密吸取莪术挥发油0.5ml ，加无水乙醇9.5ml ，溶解，即得，备用。

（0.05μl 油/μl 乙醇）。

② 莪术挥发油-β环糊精包合物样品液的制备（B ）
精密称取包合物适量（相当于含有0.5ml 莪术挥发油的量），加无水乙醇9.5ml ，振荡，取上清液，备用。

⑶ TLC 条件
用微量进样器精密分别吸取样品液A 、B 各10μl ，点于同一硅胶G 板上，以石油醚：乙酸乙酯（9：1）为展开剂，展开前将板置展开槽中饱和10分钟，上行展开，展距15cm ，1%香草醛浓硫酸液为显色剂，喷雾烘干显色。

2．差热分析（DTA ）
⑴ 样品的制备：莪术挥发油为样品a ，β-环糊精为样品b ，包合物为样品c ，按包合物中的比例量称取莪术挥发油与β-环糊精，制成莪术挥发油与β-环糊精的混合物为样品d 。

⑵ DTA 条件：测定气N 2为40ml/min ，量程为±100uV ，升温速度为10℃/min ，走纸速度600mm/h ，样品与参比物的称量大致相等。

（三）莪术油-β环糊精包合物中含油量的测定
1．精密量取莪术油1ml ，置圆底烧瓶中，加蒸馏水100ml ，用挥发油测定法提取莪术油，并计量。

2．称取相当于1ml 莪术挥发油的包合物置圆底烧瓶中，加水100ml ，按上述方法提取莪术挥发油并计量。

根据所测数值，利用下述公式计算包合物的含油率、利用率及收得率。

（1）
（2）
（3）
%100)()(⨯=g g 包合物量包合物中实际含油量含油率%100)()(⨯=ml ml 投油量包合物中实际含油量利用率%100)
()()
(⨯+-=g g g 投油量环糊精包合物实际量包合物收率β
（四）含量测定（紫外分光光度法）
1．对照品溶液的制备
精密称取莪术醇250mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密吸取其1ml，置50ml容量瓶中，加10%聚山梨酯-80 1ml，用无水乙醇定容至刻度（0.2mg/ml）。

2．样品溶液的制备
⑴莪术挥发油样品液的制备
精密量取莪术挥发油0.1ml，置25ml容量瓶中，加10%聚山梨酯-80 0.5ml，加无水乙醇稀释并定容至刻度，即得。

⑵莪术挥发油-β环糊精包合物样品溶液的制备
精密称取相当于含有0.1ml莪术挥发油量的包合物，加20ml无水乙醇，振摇10分钟，静置1小时，过滤，滤液置25ml容量瓶中，加10%聚山梨酯-80 0.5ml，加无水乙醇定容至刻度，即得。

⑶空白溶液的制备
精密量取10%聚山梨酯-80 0.5ml置25ml容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，即得。

3．测定方法
精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各0.5ml，置100ml容量瓶中，用0.2%香草醛硫酸液定容至刻度，摇匀，放置30分钟，于510nm处测定吸收度，按下式计算莪术醇含量。

C x=（A x/A r）C r
式中Cx-供试品溶液的浓度，Ax-供试品溶液的吸收度，Cr为对照品溶液的浓度，Ar-对照品溶液的吸收度。

四、实验结果与讨论
1．包合物的含油率、利用率及吸收率见表1。

表1. 包合物的含油率、利用率及吸收率
样品含油率% 利用率% 收得率%
包合物
2．包合物形成的验证
（1）绘制TLC图，说明包合前后的特征斑点与Rf值的情况，说明包合物的形成。

（2）绘制DTA图，说明包合前后与混合物等的峰形与峰温，说明包合物的形成。

3．含量测定结果见表2
表2.包合物的含量测定结果
样品A x A r C x Cr % 挥发油
包合物
五、思考题
１.制备包合物的关键是什么？应如何进行控制？
2．制备包合物时，主分子对客分子有何要求？
3．验证包合物的方法有哪些？
（范晓文）。