分子克隆常用工具酶 PPT

Hind Ⅲ 代表从流感噬血杆菌(Haemophilus influenzae) d 株中 分离到的第3个限制酶。
三、限制性核酸内切酶学特性
一般分子量为60kd，单链多肽，最适 pH 为 6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复
冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加 相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。
因此，酶是 DNA 重组技术中必不可少的工具。
核酸水解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶
磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
用于核酸操作的常用工具酶
➢ 限制性核酸内切酶 ➢ DNA连接酶 ➢ DNA聚合酶 ➢ 核酸酶 ➢ 核酸修饰酶
一、限制性核酸内切酶的分类
二、 限制性核酸内切酶的命名原则
名
属种 株序
称
名 名名 号
EcoRⅠ E co R Ⅰ
Hind Ⅲ H in d Ⅲ
HindⅡ H in d Ⅱ
HpaⅠ H pa / Ⅰ
菌株来源
Escherichia coli R Haemophilus influenzae d Haemophilus influenzae d Haemophilus parainfluenzaea
稳定性和活性 ④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在-20℃ 保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度 过高，影响酶切反应 ⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜 ⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、 RNA等杂质会影 响酶切反应的速度和完全程度酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位 置会影响酶切反应。
克隆目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割 和连接，制成重组DNA→导入宿主细胞→筛选、鉴定 →扩增和表达。
工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、 聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来， 需 要 各 种 限 制 性 核 酸 内 切 酶 （ restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需 要 DNA 聚合酶（polymerase）等。
限制性内切酶 Restriction enzymes
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的
特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
限制性内切酶是一种能识别 DNA 上特定碱基组成的序 列并在这些序列位点上切断DNA分子水ຫໍສະໝຸດ Baidu磷酸二酯键的一 种内切核酸酶。
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
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常用的工具酶性质及功能
第一节 分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的
特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
“分子胶”
⒉ DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平
头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分 子。
位点偏爱（site preference）
某些限制性内切酶对不同位置的 同一个识别序列表现出不同的切割 效率。
第二节 DNA连接酶 DNA Ligase
一、DNA连接酶性质
定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露 的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸 二酯键，使断开的DNA•裂口连接起来 功能：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、 复制和损伤后的修复中都起关键作用。
Bam HⅠ
5`---G
GATC C---3`
3`---C CTAG
G---5`
5`---AGATCT---3` 3`---TCTAGA---5`
Bgl II
5`---A
GATC T---3`
3`---T CTAG
A---5`
四、影响酶切反应的条件*
① 温度：一般37℃ ② 盐离子浓度：Na＋，Mg2＋ ③ 缓冲体系：具有稳定 pH 环境的Tris-HCl缓冲体系 DTT用于保持酶
DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高5-10倍 由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故
在平末端连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA 及载体DNA浓度均要求较高。 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 时间：过夜最好
每一种酶都有各自特异识别位点
它对底物要求有特异 的序列，通常的识别序列 是4 bp ～6bp，有些则 为7bp～8bp，甚或多于 8bp。
多数限制酶的识别序 列为回文结构，在识别序 列内或其附近水解DNA链 中的磷酸二酯键。
不同限制性内切酶切割的三种结果
同尾酶
5`---GGATCC---3` 3`---CCTAGG---5`
第二章 分子克隆常用工具酶
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DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链，极性相反，反向平行 • 以中心为轴，向右盘旋
Replication
分子克隆操作过程：
II 型限制性核酸内切酶酶解反应体系
“星”活性Star activity
“星”活性：高浓度的酶、高浓度的甘油、 低离子强度、极端ppH值等，会使一些核酸内切 酶的识别和切割序列发生低特异性所谓的现象。
在名称右上角加一个星号(*)表示,•如EcoRⅠ*： AATT ；EcoRⅠ：GAATTC
必须采用规范的实验步骤, 应用推荐的反应条 件。
二、常用连接酶 两种DNA连接酶比较
三、DNA连接酶的反应条件
❖ 连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数 内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持 连接酶活性的最佳反应温度却是37℃ 但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳 定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适 温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜。