实时荧光定量PCR测定基因表达量

实时荧光定量PCR测定基因表达量
一．实验目的
1、了解实时荧光定量PCR的测定原理，并与一般PCR比较。

2、掌握实验方法和荧光定量PCR仪的使用方法。

2、用实时荧光定量PCR测定基因表达量并进行结果讨论
二．实验原理
1、基本原理：
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性及定量分析的方法。

2、荧光定量PCR的重要参数和曲线：
（1）扩增曲线：荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用上图的形式，当然，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。

（2）阈值线：在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。

（3）Ct值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

在扩增曲线中（循环数为横坐标，荧光强度为纵坐标），存在一段对数增加区，在这段对数区中设一个阈值，对于不同的起始拷贝数的样品，Ct值不同。

拷贝数越多，Ct值越小。

3、荧光定量PCR的数学原理
理想的PCR反应：X=X0*2n
非理想的PCR反应：X=Xo(1+Ex)n
n ：扩增反应的循环次数
X：第n次循环后的产物量
X0：初始模板量
Ex：扩增效率
在扩增产物达到阈值线时：
X Ct=X0（1+Ex)Ct=M (1)
XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量
在阈值线设定以后，它就是一个常数，我们设为M
方程式（1）两边同时取对数得：
LogM=logX0（1+Ex)Ct (2)
整理得：
logX0=-log（1+Ex)*Ct+logM (3)
绝对定量：先用已经不同拷贝数梯度的标准样品得到一条LogX0与Ct值的标准曲线，再将样品的Ct值代入求得样品的拷贝数X0。

相对定量：通过比较两个或多个处理的样本之间的基因表达差异，来研究处理的效果。

该方法需要内参基因作为参考点，内参基因一般为β-actin等看家基因（看家基因是指维持细胞最低限度功能所不可少的基因，其在细胞内的表达量或拷贝数恒定）。

存在两种方法：
1）双标准曲线法。

对内参基因和目标基因分别做标准曲线，求出处理前后，两者的溶度。

代入公式：F=（处理前目标基因溶度/处理前内参基因溶度）/（处理后目标基因溶度/处理后内参基因溶度）。

2）2- Ct法，该法的前提条件是内参基因和目标基因的扩增速率都为1.
F=2－（处理后目的基因的Ct值－处理后内参基因的Ct值）－（处理前目的基因的Ct值－处理前内参基因的Ct值）
推导过程：处理前：X=X0 ×2ct 1 （目的基因）G=G0 ×2ct 2(内参基因)
X/G=k=X0 ×2ct 1 / G0 ×2ct 2
处理后：k=X
×2ct 3 / G0 ×2ct 4 ②
末
①②整理得：X末/X0=2－((Ct4－Ct3)－(Ct2－Ct1))
三．实验步骤
（一）RNA 的提取
1.向每107个细胞中加入1-2ml的RNAiso Plus
2.用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀
3.室温静置5分钟
4.12000g 4ºC离心5分钟
5.小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）
6.向上述步骤的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus 的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低，易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。

待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静止5分钟
7.12000g 4ºC离心15分钟
8.从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。

吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）
9.向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30ºC 下静止10分钟
10.12000g 4ºC离心10分钟.一般在离心后，试管底部会出现沉淀
11.小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000g 4ºC离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）
12.室温干燥沉淀2-5分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解）加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，至RNA沉淀完全溶解。

（二）一步法Q-PCR加样
1. 用微量核酸分光光度计测量RNA浓度
2. 加样，加样成分如下表
试剂使用量
12.5 ul
2×one Step SYBR RT-PCR
Buffer4
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 1 ul
PCR Forward Primer(10 uM) 1 ul
PCR Reverse Primer(10 uM) 1 ul
Total RNA 2 ul
RNase Free dH20 7.5 ul
Total 25 ul （三）QPCR
Q-PCR 上机操作
PCR反应管先用离心机轻轻离心后放入Thermal Cycler Dice○R Real Time System II中进行Real Time PCR反应，反应程序如下：
四．实验数据及处理
1、测得的RNA浓度：C=548.5 ng/μl
M=424.4 ng/μl
2、纯度检测：1）OD260/OD280：C=1.259；M=1.266
2）OD260/OD230：C=0.734；M=0.978
3、C(t)值
F=2-ΔΔCt=2-[(26.66-11.83)-(23.34-7.12)]=21.39=2.62
4、扩增曲线
5、溶解曲线
6、溶解峰
五、实验结论
1、纯RNA的OD260/OD280值应该在1.7~2.0之间。

C12和M12比值分别为
1.259和1.266，小于1.7，说明有蛋白质的污染。

OD260/OD230用于估计去盐的程度，应大于2。

C12和M12的比值均小于2，说明去盐不充分。

2、F值为2.62，说明经Mg2+处理过的细胞中DGAT2基因的表达量是未处理细胞的2.62倍，表达水平提高。

3、溶解峰曲线说明溶解峰都是单峰，无非特异性荧光，说明指示引物无污染，引物设计及引物浓度都比较适合。

4、扩增曲线说明，同一样品的重合性较差，初始DNA含量越多，Ct值越大。

六、实验讨论
在PCR实验中，提取的核酸质量十分关键，RNA的提取很容易受到DNA 和蛋白质的污染。

加样过程很重要，样品要充分混匀；平行实验加样量应该恒定；一般母液加样是固定体积的 1.2倍的量，因为加样过程会有液体的损失。

RNA 抽提结果不理想与RNA抽提过程中实验的不规范操作是有关系的，而且加上RNA的不稳定性，更要求实验过程的认真与小心。

荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。

必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。

纯RNA的OD260/OD280值应该在1.7-2.0之间。

C12和M12比值分别为1.259和1.266，小于1.7，说明有蛋白质的污染。

所以，本次实验中的关键问题都出在了提取和处理RNA样品的过程中，而在提取和处理RNA样品的过程中，主要问题就是防止RNA酶的污染。

RNA酶污染无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNA酶的污染，从而导致整个实验的失败。

因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。

比如：（1）避免在操作中说话聊天。

也可以戴口罩以防止引起RNA 酶污染；（2）尽量使用一次性的塑料制品，尽量避免公用器具如滤纸，PCR管，EP管等，防止交叉污染；（3）操作过程中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到EP管或污染用具，尽量避免使用一次性塑料手套；（4）在超净台中按照细胞培养的要求进行操作，可以有效避免操作中引起的RNA酶污染。