高效液相色谱法测定饲料中硫酸粘杆菌素含量

$ " 从整体来看 ! 准确度和精密度均较好 ! 变异系数 均小于 $ 8 "
图0
(<4= 图谱
!%$
干扰实验
分别向色谱进样中添加饲料中
注 (? %!" !2514 硫酸多粘菌素 > 标准溶液 #@ % 空白饲料 #A % 硫 酸 粘 杆 菌 素 添 加 量 0"" 125;2 饲 料&
常见成分组蛋白 ’ 纤维素酶 ’ 维生素 = ’ 甘氨酸 ’ 谷 氨酸的甲醇溶液 ! 结果表明 ! 在该色谱条件下上述
L 关键词 M 硫酸粘杆菌素 & 高效液相色谱 & 超声提取 & 旋转蒸发 L 中图分类号 M NI:J;:# L 文献标识码 M 5 L 文章编号 M :""B>AA:B!!""# ""$>""AO>"A L!"#$%&’$M 5 F1D,H 1-H .,*D(3 *32C’H 0’F H323F*,-12,’- ’0 4’(,.2,- ./(0123 ,- 033H ,. DF3.3-23H P,2C 7,?C &3F0’F*1-43 8,Q/,H 9CF’*12’?F1DC) !7&89 ";RC3 *32C’H 4’-.,.2. ’0 /(2F1.’-,4 3+2F142,’- ’0 4’(,.2,- ./(0123 ,- 033H .1*D(3 #4’-H3-.1! 2,’- ’0 2C3 3+2F142,’- (,Q/,H G) F’21F) 3S1D’F12’F#1-H H323F*,-12,’- G) 7&89;T-H3F 2C3 ’D2,*1( 4’-H,2,’- #4’(,.2,- ./(0123 1-H ,*D/F,2) ,- 3+2F142,’- (,Q/,H P1. P3(( .3D1F123H #1-H ,2. 4’-43-2F12,’- C1H 1 (,-31F F3(12,’-.C,D P,2C D31U 1F31 ";$ % B"" !?V*8!FW";OOJ# "&2C3 F34’S3F F123 ’0 033H .1*D(3 P1. I#;A K%::!;J K #1-H F3(12,S3 .21-H1FH H3S,12,’- P1. (3.. 2C1$ K &2C3 H323F*,-12,’- ’0 4’(,.2,- ./(0123 P1. -’2 ,-23F03F3H G) ’2C3F 4’**’- 4’*D’.,2,’- ,- 033H#1-H 2C3 *32C’H C1H 1 P,H3 1H1D2,S3 F1-?3;5. 1 F3./(2#2C3 *32C’H 4’/(H G3 1DD(,3H 2’ 2C3 H323F*,-12,’- ’0 4’(,.2,- ./(0123 ,- 033H; L()* +,%-#M 4’(,.2,- ./(0123 &7&89&/(2F1.’-,4 3+2F142,’- &F’21F) 3S1D’F12’F
所 "#甲醇 %乙腈为色谱纯 #其余试剂均为分析纯 $
:;!
提取方法
取饲料样品 !"" ? # 粉碎过 ";B$
** 孔径的筛 # 充分混匀 # 装入磨口瓶中备用 $ 准 确称取 $ ? 饲料 # 加入 :$" *8 :" K 的甲醇溶液 # 超声波 提取 !" *,-$ 将 提 取 液 全 部 转 移 到 :""" *8 鸡心瓶中 ##" # 旋转蒸发器蒸干 # 用去离子水 $ *8 溶解残渣 # 溶液过 ";B$ !* 有机微孔滤膜 # 用 7&89 测定 $ ! 结果与分析 !;: 硫酸粘杆菌素提取条件的选择 !;:;: 不同浓度甲醇对回收率的影响 $ 在固定液
密度都较好 "
!7&
方法适用性实验
表$
配合饲料 浓度 $123;2 %
配合饲料 ! 浓缩饲料 ! 添加剂预混合饲料准确度和精密度
浓缩饲料 添加剂预混料 回收率 $8 % 浓度 $123;2 % 回收率 $8% 浓度 $123;2 %
回收率 $8 %
!7$ *7"" +7"" 0&7"" 6"7"" &"7""
0"!70 ,#7+ +#76 +,7$ 0"+7+ ,"7*
01
流动相流速 "+/.+23 #
4 乙晴!4 硼 砂 #$!!$ $$!%$ #$!!$ $$!%$ #$!!$ $$!%$ #$!!$ $$!%$
分离效果 能分开 !’ 组分峰形前伸 不能与杂质分开 不能与杂质分开 能分开 !) 组分峰形拖尾 分离良好 ! 但出峰时间长 能分开 !) 组分峰形前伸 不能与杂质分开 能分开 ! 但与杂质分离差
砂缓冲液组成不同比例流动相 ! 不同流速下 ! 在
?,<@AB 9BCD3EF>(7 色谱柱上 ! 以同一饲料样品每
次进样 !" !/! 以硫酸粘杆菌素与杂质的分离效 果 ( 保留时间及其他参数为指标 ! 进行选择 ! 结果 见表 %& 结果表明 ! 流动相为乙腈 G01 *&" 硼砂缓冲 液 "4
料比为 A"$:# 超声提取时间为 !" *,- 的条件下 # 使用不同浓度的甲醇对硫酸粘杆菌素回收率的结
: :;:
材料与方法 主要仪器与试剂
<=>:""6 型超声 波清洗
果见表 : $
万方数据
%"
表(
甲醇浓度
中国饲料
!""# 年第 $ 期
不同浓度甲醇对回收率的影响
回收率 甲醇浓度
5
使用不同的液料比进行提取 ! 其对硫酸粘杆菌素 回收率的结果见表 6 &
$7"" 0!7$" !$7"" *"7"" +"7"" 0!"
0"!76 ,07! ,+7$ ,,7# ,"7# 00!7&
!07"" $"7"" 0"" 0&" 6!" *+"
++7, ,"7# 0"&7! +,7& ,07& ++70
成分均不干扰硫酸粘杆菌素的测定 &
*7#+ 8" 以上数据充分说明该方法的准确度和精
乙晴
!&(&6
料液比对回收率的影响 & 在固定以 (" 5 甲
表%
硼砂缓冲液浓度 "&"! +,-./
醇为提取液 ! 超声作用时间为 !" +23 的条件下 !
!4 硼 砂 ;#$!!$$! 流速为 "&# +/.+23 !检测波
硼砂缓冲液浓度 "&"$ +,-./
流动相选择结果
01
流动相流速 "+/.+23 $
!""# 年第 $ 期
中国饲料
AO
检 测 分 析
!"#$%&’()*+,-./01234
河北工业大学生物工程系 佟 斌 吴兆亮
L 摘要 M 本文提出了通过高效液相色谱法 !!"#$ " 快速 # 简便测定饲料中硫酸粘杆菌素的含量 $ 该方法首先用超
声波法提取饲料中的硫酸粘杆菌素 % 通过旋转蒸发将提取液浓缩后 % 利用 !"%$ 进行检测 $ 结果表明 % 在最优检测条 件下 % 提取液中硫酸粘杆菌素与杂质分离良好 % 其浓度为 &’( ! )&& !*+,# 与 峰 面 积 呈 线 性 相 关 !-.&’//01 "& 饲 料 样 品回收率 21’3 4 ! 556’0 4 % 变异系数 !789 " 小于 ( 4 & 其他饲料常规成分在实验条件下对硫酸粘杆菌素测定均无干 扰 % 此方法的适用范围广 % 可满足饲料中硫酸粘杆菌素的检测 ’
由表 6 可知 ! 随着提取液用量的增大 !硫酸粘 杆菌素回收率也不断增大 ! 当液料比达到 6"!( 以 后 !提取率用量的增加对回收率提高影响非常小 ! 而且提取液回收时能耗也会增大 ! 因此液料比选 取 6"!( 较好 &
!&(&!
超声作用时间对回收率的影响 & 在固定以
(" 5 甲醇为提取液 ! 料液比为 (!6" 的条件下 ! 进
超声作用时间对回收率的影响
回收率 "5 $ 超声时间 "+23 $ 回收率 "5 $
! $ (" ($
6(&! $"&% #6&! 7*&#
!" !$ %"
8*&7 8*&8! 8#&"*
!&6
色谱条件的测定
将乙晴与不同 01 值下硼
由表 ! 可知 ! 随着超声作用时间的增加 ! 回收 率逐渐增大 ! 但当作用时 间达到 !" +23 后 ! 回 收 率几乎不变 !此时如果继续增加作用时间 ! 反而会 增加杂质的溶出 ! 因此超声作用时间以 !" +23 为 宜&
硫 酸 多 粘 菌 素 % !&’()*)+,- % ./(0123 "# 又 名 硫酸粘杆菌素 !4’(,.2,- ./(0123 " 是一种环状多肽类 抗生素 # 主要成分为硫酸粘杆菌素 5 和硫酸粘杆 菌素 6 $ 硫酸粘杆菌素对革兰氏阴性菌有强烈的 抑菌作用 # 并且具有高效 %低毒 %低残留的特点 $ 目 前硫酸多粘菌素主要用作饲料添加剂 # 防治由大 肠杆菌 %绿脓杆菌 % 沙门氏菌等革兰氏阴性菌引起 的猪 % 牛 % 鸡等畜禽肠道疾病 $ 硫酸粘杆菌素在饲料中的添加量有严格规 定 # 因此必须准确检测饲料中硫酸粘杆菌素的含 量 $ 目前主要采用微生物法测定硫酸多粘杆菌素 含量 #但是微生物法具有操作步骤复杂 % 周期长等 缺点 # 为满足实际需要 # 必须开发一种快速 % 准确 的检测方法 $ 本文采用超声波提取饲料中的硫酸 粘 杆 菌 素 # 根 据 高 效 液 相 色 谱 !7&89 " 的 测 定 原 理 # 建立了 7&89 测定饲料中硫酸粘杆菌素含量 方法 $
"&# % (&$ "&# * (&$
长 !($ 3+! 硫酸粘杆 菌素 ) 的保留 时 间 为 (6&6
!&%
线性范围 ! 精密度和准确度
在该实验条件
+23 ! 硫酸粘杆菌素 ’ 的保留时间为 (#&$ +23! 所
得色谱峰峰形较好 ! 并且实现了硫酸粘杆菌素与 杂质的良好分离 ! 见图 ( &
下 ! 硫酸多粘菌素 9 标准溶液的浓度在 "&$ " %""
行不同的超声作用时间 ! 其对硫酸粘杆菌素回收 率的结果见表 !&
表!
超声时间 %+23 $
!&!
提取液的富集
采用旋转蒸发仪 7$ # 将提
取液蒸干 & 选取了去离子水 ( 乙腈 ( 流动相 6 种溶 液各 $ +/ 溶解鸡心瓶内的残渣 ! 测得回收率分 别是 8%&% 5 ($8&( 5 (#6&7 5 & 用乙腈与流动相溶 解残渣时 ! 溶解不完全 ! 收率低 ) 用去离子水溶解 残渣时 ! 鸡心瓶内残渣溶解充分 ! 回收率高 & 将溶 液过 "&%$ !+ 有机微孔滤膜过滤 ! 即可用 1=/> 测定 &
表6
液料比
回收率
$ (" !"
87&* 8*&$ 7"&6
$" (""
*$&8 %7&7
液料比对回收率的影响
液料比 回收率 "5 $
回收率 "5 $
$!( ("!( !"!(
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6"!( %"!( $"!(
8#&*! 硫酸粘杆菌素在纯水中最容易 溶出 ! 随着甲醇浓度的增大 !硫酸粘杆菌素的溶出 受到明显抑制 & 但是纯水中杂质溶出比较多 ! 当使 用 (" 5 的甲醇溶液作为提取 液时可以显 著抑制 杂质的溶出 !并且与纯水回收率相差很小 ! 因此选 取 (" 5 甲醇作为提取液较好 &
器 ! 昆山市超声仪器有限公司 "&5?,(3-2::"" 高效 液相色谱仪 !@:A:!5 二元泵 #@:A:B5 紫外检测 器 #!" !8 定 量 环 #CD 化 学 工 作 站 "#E’FG1+ %+!
23-H>9:I 色 谱 柱 !B;J ** "!$" **#$ !*"& 硫 酸 多粘菌素 % 标准品 ! 购自中国药品生物制品检定
!:.+/ 范围内与峰面积呈线性相关 & 线性回归方 程为 ’!;%*87&!*6" "<;"&88*#$& 以 6"&"" !:.+/ 硫
万方数据
!""# 年第 $ 期
中国饲料
*0
酸多粘菌素 > 标准溶液连续进样 0" 次 ! 峰面积 响应值的变异系数为 "%6 8 " 以猪的配合饲料 ’ 浓缩饲料 ’ 添加剂预混合饲 料为基础 !每个样品选 & 个水平 ! 每个水平做 $ 次 重复以检测该方法的准确度和精密度 ! 结果见表
4 乙晴!4 硼 砂 #$!!$ $$!%$ #$!!$ $$!%$ #$!!$ $$!%$ #$!!$ $$!%$
分离效果 分离好 ! 峰形对称 分离好 ! 但 ’ 组分峰形前伸 不能与杂质分开 不能与杂质分开 与杂质分离效果差 能分开 !’ 组分峰形拖尾 与杂质分离效果差 不能与杂质分开
"&# % (&$ "&# * (&$