基因克隆常用的方法

图6 phage display克隆基因示意图
Phage display的基本操作过程为:(1)提取某一病原体基因组DNA,用 超声波将DNA切割成500～1 500的片段;(2)将片段末端用T4DNA聚合酶 处理后,与载体DNA(phagemid)连接形成噬菌体质粒。用这些质粒与辅 助噬菌体(helper phage)同时转染大肠杆菌。phagemid在大肠杆菌内包 装成噬菌体,大量繁殖,同时将插入的外源基因片段表达,表达产物主要 集中在噬菌体颗粒的表面；(3)将特定的受体固定于载体上(多为ELISA 板),方法同一般的ELISA包被。将噬菌体悬液作适当稀释后,加入平板 孔内,感作一段时间,用PBS等缓冲液漂洗。最后,只有表达特异功能蛋白 的噬菌体才能与包被在平板上的受体相互结合,那些表达非相关蛋白的 噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱;(4)用高强度NaCl液将结合在受体 上的噬菌体分离下来,再感染大肠杆菌,便可将编码特异功能蛋白质的 基因克隆。
图1 应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物
AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度 (annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。APPCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。 如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物 或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关 的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主 要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测 到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定 其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引 物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然 后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买)。
目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是 免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必 要采用两步扩增法,即nested PCR。
其基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有共同的基 因掩盖起来,而只暴露出特异的基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。 其操作程序为:(1)用同一限制性内切酶(一般用Bam HI,Bgl II或Hind III)同 时处理靶基因组和掩盖基因组DNA，其中掩盖基因组DNA的量至少要2倍于靶基 因组DNA的量；(2)在经酶切的靶基因组片段的两端加上连接头,其序列与酶切 产生的粘性末端的序列相对应；(3)将2个基因组的DNA混合后,高温变性,低温 退火。由于掩盖基因组DNA的量远大于靶基因组DNA量,那么与掩盖基因组DNA 相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因才能重新组 合,不会受掩盖基因的影响；(4)用Taq DNA聚合酶将粘性末端补齐后,加入与 连接子相对应的引物,经过30个左右的PCR扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基 因不同的特异基因扩增出来。这种方法的起始操作程序较复杂,各反应步骤要 求准确无误,但其检测的准确度较高。对于基因组内的点突变、重排、插入序 列等变化均可检测出来。
4 用特异抗体克隆基因
用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性。一般以单克 隆抗体最为理想。获取特异抗体的方法主要有:(1)制备识别 功能抗原的单克隆抗体;(2)将SDS-PAGE分离的蛋白质特异 带切下免疫动物,其抗体只识别该特异蛋白质;(3)用Westernblot法将识别某一蛋白质带的抗体从膜上洗脱下来。在获 取理想的抗体后,便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库 或cDNA文库,从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆 出来。
3.2 Differential display PCR(DD-PCR)
DD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RT-PCR 方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因表 达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物的 成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列,根 据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所 有的mRNA分子分为12类(见图3)。
3 未知序列的基因打靶
根据已知序列进行基因克隆,多数是重复 别人的工作,或者是在别人工作的基础上继 续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过 程。对未知序列的基因克隆才是真正的创 造性研究。
3．1 随机引物法克隆未知序列基因
随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或 RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相 关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发 生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关 闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因 很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物, 其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表 型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同 表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一 致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关 系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图1)。
基因克隆的几种常用方法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测源自文库reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点
突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
2 根据已知探针克隆基因
这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放 射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组 DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定 的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这 种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基 因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(high stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节 省时间。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
5 特异基因的功能克隆
它是借助于基因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的一 种方法。基因的功能克隆主要有2种:一是phage display,另一是peptide display。后者的原理与前者基本相同。目前以phage display的应用最为广 泛。
任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫,在其对宿主侵入或致病过程 中,病原体本身的蛋白质成分(ligand)需要首先与宿主细胞上的受体 (receptor)相互识别连接。如口蹄疫病毒需要借助于受体细胞上的Heparan sulfate受体，并与其相互作用后才能侵入细胞内；巴贝斯虫裂殖子需借助于 宿主的补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。对病原体与 宿主受体相互作用成分的特性与功能分析,是制订免疫预防措施及制备阻断药 物的前提。phage display法是克隆病原体ligand的一种最为理想的手段。
PCR反应模式图：
Nested PCR反应模式图
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。 在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法 克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
图４DD-PCR示意图 箭头所示为特异扩增产物
3.3 Representative difference analysis PCR (RDA-PCR)
这是一种差减杂交 (subtractive hybridization) 与PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCR 和DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR 扩增,最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带, 其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再 扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异 基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。
其网上地址为:ebi.ac.uk/ebi-home.html; (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,
其网上地址为:ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确 度比较高,而 TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。