色谱法叶绿素分离实验精品PPT课件

❖想一想 在吸附色谱
中，以硅胶为固定相， 当用三氯甲烷为流动 相时，样品中某些组 分保留时间太短，若 改用三氯甲烷–甲醇 （1:1）时，则样品中 各组分的保留时间是 变长，还是变得更短？ 为什么？
4．吸附柱色谱操作技术
❖ （1）装柱
❖ A.质量要求
装柱之前，先将空柱洗净干燥，再将空柱垂 直固定在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取 一小团脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平铺上 一层厚0.5~1cm的洗过、干燥石英砂，有助于分离时色层 边缘整齐，加强分离效果。柱的长度与直径比一般为10 ~ 20:1。色谱柱的填装要均匀，不能有气泡。
（5）检验 可以为后续操作
二、凝胶柱色谱技术 1．分离原理
（1）凝胶
(2)分离原理
凝胶的孔穴大小与 被分离组分大小相当，尺 寸大的组分分子可以渗入 到凝胶的大孔内，但进不 了小孔，甚至于完全被排 斥先流出色谱柱。尺寸小 的组分分子，大孔小孔都 可以渗进去，最后流出。
2．固定相 ❖ (1)无机凝胶又称硬质凝胶----多孔硅胶、多孔玻璃珠
❖ （1）要求 流动相必须与凝胶本身非常相似，能溶解样
品，浸润凝胶，且具有较低的黏度，有利于大分子的扩散 ❖ (2）选用方法
水溶性样品 -------水溶液为流动相 非水溶性样品 ------有机溶剂为流动相 ❖ (3）常用的流动相
四氢呋喃、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、三氯甲烷 和水等
4．凝胶柱色谱操作技术
液-固色谱(LSC)
液相色谱(LC) 液-液色谱(LLC)
1.流动相状态
气相色谱(GC)
气-固色谱(GSC) 气-液色谱(GLC)
超临界流体色谱(SFC)
2.按分离原理分类
吸附色谱 分配色谱（DC） 离子交换色谱（IEC) 分子排阻色谱(MEC） 亲和色谱
3.根据实验操 作形式
柱色谱 (CC） 薄层色谱（TLC）
❖ （5）流动相（mobile phase）
液体流动相 气体流动相 超临界流体流动相
❖ (6）色谱分离本质: 利用混合物中各组分在流动相和固定相之间相互作用力 （如溶解能力、吸附力、极性、亲和力等）的强弱不同， 而使各组分在色谱柱中分别以不同的速度移动而达到分离 的定性与定量分析的方法。
二、色谱法分类
4～5
分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸 性色素。
（3）聚酰胺 A.吸附机制：通过分子内的酰胺基与酚、酸、硝基、醌类化
合物形成氢键而产生吸附作用 B.应用范围：适合于含-OH 的天然产物的有效成分分离
（4）大孔吸附树脂 A.吸附机制：大孔网状结构的高分子化合物，不溶于酸、
碱及有机溶剂，吸附性与筛分性原理相结合 B.应用范围：主要用于水溶性化合物(如皂苷）的分离纯
氧化铝含水量% 0 5 15 25 38
活度级 I II
III IV V
活性 大
小
C.氧化铝分类及应用范围
氧化铝种类 pH
应用范围
碱性氧化铝 9～10 分离碱性和中性化合物，如生物碱。
中性氧化铝
分离酸性、中性和碱性化合物，如生物
7.5
碱、挥发油、萜类、甾体以及在酸碱
中不稳定的酯类、苷类等化合物。
酸性氧化铝
❖ B .装法 ①湿法装柱
②干法装柱
（2）加样 ❖ ①干法加样 ❖ ②湿法加样
（3）洗脱 ❖ ①洗脱剂
一种溶剂或几种溶剂按一定比例组成混合溶剂 ❖ ②操作要求 A.保持吸附层上方有一定量的洗脱剂，防止断层和旁流 B.控制洗脱剂的流速（5～10滴/min)
（4）收集 ❖ ①等份收集
(亦可用自动收集 器) ❖ ②按变换洗脱剂收集
第8章 经典色谱分离实用技术
学习目标 知识目标
掌握吸附薄层色谱和纸色谱分离原理、常用分离参 数和系统适用性指标；熟悉经典柱色谱、薄层色谱和纸 色谱操作方法；了解色谱的分类和吸附薄层色谱、纸色 谱、经典柱色谱的色谱条件选择原则。 技能目标
掌握吸附柱色谱制备技术和薄层板制备、点样、展 开和显色检视等操作技术；熟悉薄层色谱、纸色谱的仪 器和材料；了解纸色谱和经典柱色谱的操作规程。
一、色谱法
第1节 色谱法概述
Tswett叶绿素分离实验
❖ （1）色谱：植物色素经溶剂冲洗分离后如同白光色散成七 色光带的现象
❖ （2) 色谱法：用于产生色谱的分离方法 ❖ （3）色谱柱（chromatographic column）
装有用于分离的填充物的细长管（如玻璃管、不锈钢管）
❖ （4)固定相（stationary phase） 固体固定相 液体固定相
化
3．流动相(又称为洗脱剂 ) ❖ （1）流动相影响因素
官能团极性与数目
A.被测物质的结构、性质 物质的结构
结构空间排列
常见官能团的极性由小到大的顺序是：烷烃＜烯烃＜醚类＜ 硝基化合物＜酯类＜酮类＜醛类＜硫醇＜胺类＜酰胺＜醇 类＜酚类＜羧酸类。
B.流动相极性: 相似相溶 C.吸附剂活性
❖ （2）如何选择流动相？ 最佳方案总是实验确定
性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐 高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱分离效 能较低 ❖ (2)有机凝胶又称半硬质凝胶
性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动 相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱分离效能较高。但 在有机溶剂中有轻度膨胀。 ❖ (3)新型凝胶 ---葡萄聚糖凝胶
3．流动相
平面色谱(PC） 纸色谱（PC) 薄膜色谱（TFC）
三、色谱法的特点
分离效能高 分离与分析功能兼备 自动化程度高 应用范围广
第2节 经典柱色谱技术
一、液-固吸附柱色谱技术 1．分离原理 （1）液-固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液 体的柱色谱法
（2）分离机制:吸附剂表面对不同组分吸附力的不同和流动相 对各组分的溶解能力（或称解吸能力、洗脱能力）的差异，最 终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序（或在色谱柱中 停留的时间即保留时间）不同而达到分离。
（3）应用:分离酸性及中性化合物 (如醇类和芳香烃等)
2．吸附剂
（1）硅胶 (SiO2·XH2O)
A.吸附机制：表面有许多硅羟基（-Si-OH）的氢键作用
B.吸附活性
C.失活或脱活
D.活化
硅胶活性与含水量的关系
硅胶含水量%
活度级
活性
0
I
大
5
II
Biblioteka Baidu15
III
25
IV
38
V
小
（2）氧化铝
A.吸附机制:其表面铝羟基（Al-OH）的氢键作用 B.活性