荧光原位杂交(FISH)_ppt课件
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荧光原位杂交(FISH)
原位杂交（ISH）
原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记 的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。 原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学 及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于 20世纪60年代。 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另 一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。
FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
发展历史
1974年Evans首次将染色体显带技术和染 色体原位杂交联合应用，提高了定位的准 确性。
探针标记
为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂 交，有必要对探针加以标记，以便在结合部 位获得可识别的信号。
荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进 行标记。 探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方 法。
均匀标记
对探针进行标记时，可复制合成一段新探针 分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从 而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特 点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入， 探针的信号强。
1974 年，Evans第一次将染色体显带技术 和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位 的准确性。 1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交 中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生 物素与RNA 分子连接起来。 1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检 测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。
20世纪90年代，随 着人类基因组计划 的进行，由于绘制 高分辨人类基因组 图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的 发展和广泛应用。
FISH样本的制备 探针的制备 探针标记 杂 交
（染色体显带） 荧光显微镜检测 结果分析
DNA RNA PNA
将探针置于载玻片上 加盖玻片
在荧光显微镜下观察
变性 检测 杂交
肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记 的原位杂交，即FISH技术。 1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列 定位到G显带标本上，标志着染色体定位技 术取得了重要进展。
1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利 用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进 行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位 杂交技术。 他们都是采用放射性同位素标记探针,需要 采用放射自显影进行检测,这种检测上的限 制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原 位杂交技术不能很快得到广泛应用。
基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基 顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度 为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易 渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小， 限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数 目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此 这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重 复序列的荧光原位杂交分析。
4 原位PCR
荧光原位杂交
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代 末在放射性原位杂交技术的基础上发展起 来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧 光标记取代同位素标记而形成的一种新的 原位杂交方法，探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫 细胞化学过程连接上荧光染料。
1
放射性同位素
3H、35S、125I、32P等
2 2
非放射性物质
荧光素、生物素、地高辛等
同位素原位杂交的不足之处： 1、不稳定 2、高背景 3、曝光时间长 4、结果统计处理繁琐 5、同位素的使用和处理
几种原位杂交技术 1 基因组原位杂交技术
2 荧光原位杂交技术 3 多彩色荧光原位杂交技术
Baidu Nhomakorabea
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷 酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放 射性原位杂交技术 。至此,以荧光标记的探针在细 胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原 位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的 可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。
探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
原位杂交（ISH）
原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记 的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。 原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学 及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于 20世纪60年代。 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另 一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。
FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
发展历史
1974年Evans首次将染色体显带技术和染 色体原位杂交联合应用，提高了定位的准 确性。
探针标记
为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂 交，有必要对探针加以标记，以便在结合部 位获得可识别的信号。
荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进 行标记。 探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方 法。
均匀标记
对探针进行标记时，可复制合成一段新探针 分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从 而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特 点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入， 探针的信号强。
1974 年，Evans第一次将染色体显带技术 和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位 的准确性。 1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交 中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生 物素与RNA 分子连接起来。 1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检 测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。
20世纪90年代，随 着人类基因组计划 的进行，由于绘制 高分辨人类基因组 图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的 发展和广泛应用。
FISH样本的制备 探针的制备 探针标记 杂 交
（染色体显带） 荧光显微镜检测 结果分析
DNA RNA PNA
将探针置于载玻片上 加盖玻片
在荧光显微镜下观察
变性 检测 杂交
肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记 的原位杂交，即FISH技术。 1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列 定位到G显带标本上，标志着染色体定位技 术取得了重要进展。
1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利 用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进 行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位 杂交技术。 他们都是采用放射性同位素标记探针,需要 采用放射自显影进行检测,这种检测上的限 制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原 位杂交技术不能很快得到广泛应用。
基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基 顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度 为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易 渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小， 限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数 目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此 这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重 复序列的荧光原位杂交分析。
4 原位PCR
荧光原位杂交
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代 末在放射性原位杂交技术的基础上发展起 来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧 光标记取代同位素标记而形成的一种新的 原位杂交方法，探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫 细胞化学过程连接上荧光染料。
1
放射性同位素
3H、35S、125I、32P等
2 2
非放射性物质
荧光素、生物素、地高辛等
同位素原位杂交的不足之处： 1、不稳定 2、高背景 3、曝光时间长 4、结果统计处理繁琐 5、同位素的使用和处理
几种原位杂交技术 1 基因组原位杂交技术
2 荧光原位杂交技术 3 多彩色荧光原位杂交技术
Baidu Nhomakorabea
1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷 酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放 射性原位杂交技术 。至此,以荧光标记的探针在细 胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
1985 年，原位杂交技术被引进到植物。
1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原 位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的 可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。
探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。