精子总RNA提取步骤
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材料与方法
一、收集标本，
采用Percoll(取80%和40%两个浓度)纯化精子。收集80%层底部精子,加入0.5ml体细胞裂解液(0.1%十二烷基硫酸钠,0.5%TritonX2100,用RNase2free的水配制,4℃保存,临用前取出冰浴),吹打分散沉淀并移至10ml塑料试管中,加入5ml体细胞裂解液,吹打混匀,置冰浴中15min,间断吹打,显微镜下确认无圆形细胞,并计数精子密度。
二、人精子RNA的提取
根据精子密度取含1～5×107精子的悬液,室温12,000g离心2min,弃上清,精子沉淀用RNeasyKit(Qiagen,德国)提取RNA。RNA提取主要步骤:精子沉淀加600μl提取缓冲液RLT(可完全裂解5×107个精子),用吸管尖头反复吹打30s;反复通过20G一次性注射器针头10次剪切DNA;加入等体积70%乙醇,吹打混匀后加至吸附柱,8,000g于室温离心15s;加700μl漂洗缓冲液RW1至吸附柱,8,000g于室温离心15s;加500μl漂洗缓冲液RPE至吸附柱上,8,000g于室温离心15s;加500μl漂洗缓冲液RPE至吸附柱,12,000g于室温离心2min;加30μl水(RNase2free,用前预热至70℃)至吸附柱的膜上,12,000g于室温离心1min,收集管中洗脱所得即为细胞总RNA。取20μlRNA,用微量核酸测定仪(Biome2tra,德国)测定其含量和纯度。RNA总量除以提取RNA所用精子数(单位:×106个)即为每106个精子RNA含量。剩余RNA加入10IU RNA酶抑制剂(TOYOBO,日本),置-70℃保存。
三、DNA酶处理及逆转录
总RNA在用于逆转录前用DNA酶I处理,取8μl总RNA,加2IUDNA酶I(Fermentas,美国),37℃处理30min,加入1μlEDTA(25mmol/L)终止反应,并于65℃保温10min灭活DNA 酶I。置冰上,加1ug Olig(dT)18(TOYOBO,日本),5μl5×逆转录缓冲液(含Mg2+),215μldNTPs(10mmol/L),20IURNA酶抑制剂和100IUMMLV逆转录酶(TOYOBO,日本),加RNase2free水至25μl。42℃逆转录1h后,95℃5min灭活RNA酶。逆转录所得cDNA作为模板用于以下聚合酶链反应(PCR)扩增。
四、PCR