第十六章 细菌基因工程

细菌基因工程的应用
• 农业领域的基因工程细菌
• 食品和工业基因工程菌
• 重组DNA技术生产医用抗生素
• 重组DNA技术生产胰岛素和药物前体 • 环境微生物基因工程菌的应用
农业领域的基因工程细菌
(一) 微生物基因工程农药 重组微生物杀虫剂——苏云金芽胞杆菌基 因工程及应用 （1）增强杀虫毒力 （2）拓宽杀虫范围 （3）延长持效期 （4）克服可能出现的昆虫抗性
微生物细胞表面展示技术的应用
开发一些独特的生物产品如活疫苗、细胞催化剂、细 胞吸附剂、生物传感器等，还能开发用于医学诊断、工业、 环境保护等的细胞受体等。
• 存在的问题：
1）开发细胞催化剂时，细胞表面酶的活性与游百度文库酶相比往 往降低； 2）在构建细胞表面蛋白库时，有些蛋白的表达量太少以至 于难以鉴定； 3）空间阻碍、多亚基蛋白的表达、多种外源蛋白的同时表 达等。
细菌基因工程的发展简史
• 1973年，波依尔(Boyer)和科恩(Cohen)首 次完成外源基因在大肠杆菌中的表达 • 1982年，第一个基因工程产品──利用构建 的基因工程菌生产人胰岛素获得成功，从 此人类进入了生物技术的产业时代。
细菌基因工程的发展现状
1、细菌工程菌与人类药物生产 • 1982年美国首先将重组胰岛素投放市场， 标志着世界第一个基因工程药物的诞生。
1）选择强启动子超量表达外源基因，最大限度地 获得蛋白质产物。 如E. coli 中的lac、tac和T7等可调控强启动子
2）采用基因自身的启动子或宿主菌的相关性状基 因的启动子表达关键基因，使宿主菌表现出一种 特殊的性状，或启动其他产物的大量合成。 不一定要高量表达，只需正常表达。
2. 转录的有效性
2、细菌工程菌与环境保护
• 原理：采用现代分子生物学和分子生态学的原理 和方法，充分利用环境微生物的生物净化、生物 转化和生物催化等特性的功能基因，构建高效表 达的基因工程菌进行污染治理、清洁生产和可再 生资源利用
• 优点： 效率高、成本低、反应条件温、无二次污染， 同时可以增强自然环境的自我净化能力。
• 应用范围： 工业和生活废水治理 重金属污染土壤的生物修复 (bioremediation) 农药残留的微生物降解 生物制浆和生物漂白 石油污染的消除 友好可再生材料的合成等
超级工程菌(superbug)
• 美国把降解芳烃、萜烃、多环芳烃的质粒 转移到能降解脂肪烃的假单胞菌体内，培 育出能同时降解4种烃类的“超级工程菌” ， 降解石油烃类的能力比野生菌高几十倍乃 至几百倍
克隆载体pAV10
四环素抗性基因(Tetr)；单个BglII限制性内切酶位点；复制起点(ori)；启动 子(p)；多克隆位点(MCS)。多克隆序列中插入目的基因，使基因处于Tn5启 动子(p)的控制之下。箭头表示转录的方向。
2、枯草芽胞杆菌表达系统
（1）穿梭载体(shuttle vector)
• 特征：同时具有大肠杆菌载体和枯草芽胞杆菌载 体的复制起点 • 举例： pDG148-Stu，利用大肠杆菌pBR322和枯草 芽胞杆菌载体pVB110的复制起点，能够超量表 达插入其StuI酶切位点的外源蛋白。
pDG148-Stu克隆表达载体
（2）整合载体(integration vector)
• 特征：能将目标基因整合到宿主的基因组中，一般通过同 源重组或转座因子的转座特性实现外源基因的整合。 • 举例： pDG1730是典型的枯草芽胞杆菌整合载体，可将外源 基因整合到-淀粉酶基因内部。 该载体的基本骨架是大肠杆菌的克隆载体和用于革兰 氏阳性细菌的红霉素抗性选择标记基因(erm)；用作整合 的元件是中间插入了壮观霉素抗性基因(spc)的-淀粉酶 基因，其中含有多克隆位点。
• 利用tag的特性可以对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯， 因此融合表达既可以保护外源蛋白不受宿主内蛋白酶的降 解，同时也大大简化了重组蛋白的纯化过程。
2．构建可分泌蛋白，分泌到胞外培养基中
• 位于蛋白质N端称为信号肽的一段氨基酸序列会帮助蛋白 通过细胞膜。通过基因操作可在外源蛋白的N端添加编码 信号肽的DNA序列，形成一个分泌蛋白。 缺陷： 仅仅是信号肽序列的存在并不能确保高效分泌，并且革 兰氏阴性细菌由于外膜的存在，也不能使分泌蛋白进入周 围的培养基。
pDG148-Stu克隆表达载体的结构特点
①具有乳糖操纵子调节基因lacI及其调控序列，使外源蛋白 的表达受IPTG的调控。
②具有一个杂合启动子，它来源于乳糖操纵子的表达调控区 域和枯草芽胞杆菌SPO-1菌株的启动子区域，有利于外源 蛋白的高效合成。
③ 3个抗性基因作为筛选标记： kan（卡那霉素抗性基因）和ble(博莱霉素抗性基因） 可同时用于大肠杆菌和枯草芽胞杆菌的抗性筛选， bla（氨苄霉素抗性基因）只能用于大肠杆菌的抗性 标记。
• 在表达载体上设法除去衰减序列或插入抗转录终 止序列以避免转录的提前终止，促使mRNA有效 地延伸和终止。
• 在终止密码子后增加终止子序列，使转录有效终 止，并延长mRNA的半衰期。
3. 翻译起始的有效性
翻译起始是多种成分包括mRNA、16SrRNA、fMettRNA，核糖体S1蛋白、蛋白合成起始因子之间的协同作 用的过程。 • 要使翻译起始效率最高，要满足以下条件： ①选用最佳起始密码子AUG（偶尔为GUG和UUG）； ②S-D序列（Shine-Dalgarno sequence）接近或与以下序 列完全相同：5′…AGGAGG…3′； ③除S-D序列外，处于起始密码前的两个核苷酸应该是A和U； ④如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能 使翻译效率提高； ⑤在翻译起始区不能形成明显的二级结构。
4）葡萄球菌的表面蛋白A(SpA)，胞外附属结构(如鞭毛)的蛋白等
• 为了将目的蛋白展示于微生物细胞表面，需要构建目的蛋 白和外表面蛋白的融合。 • 大多数目的蛋白位于融合蛋白的N端或C端，有时目的蛋 白的短片段也可以在融合蛋白的中间表达。
与细菌外膜蛋白在N端或C端连接的目的蛋白 (a)外源蛋白插入到细菌外膜蛋白暴露于表面的环中；(b)形成融合蛋白； 两种情况中，外源蛋白或肽段都是位于细菌细胞的外表面
4.翻译的有效终止
• 采用UAA或一连串的终止密码来有效终止原核细 胞翻译。
二 外源基因表达的方式
1．外源基因以融合蛋白形式表达
• 目标基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合， 构建成一个融合蛋白基因。
• 用于融合的表达标签(tag)蛋白和多肽： 六聚组氨酸肽(6xHis)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)
1、革兰氏阴性细菌通用的表达载体 2、枯草芽胞杆菌表达系统
1、革兰氏阴性细菌通用的表达载体 • pAV10
• 在低拷贝数、广宿主质粒pRK290的多克隆位点 中插入来源于转座子Tn5末端反向重复序列的一 段70bp DNA而构建。 • 来源于Tn5的DNA克隆片段包含两个独立而重叠 的启动子，每一个启动子分别负责一个Tn5基因 的转录。Tn5能有效地作用于许多细菌宿主，它 的启动子也能促进这些生物的转录。
大肠杆菌外的细菌中应用的克隆载体一般是穿梭载体， 含有大肠杆菌克隆载体的序列，便于在大肠杆菌中扩增和 制备。 例如，用于苏云金芽胞杆菌的克隆载体pHT304的基础 骨架为大肠杆菌克隆载体pUC18, 另装有能在Bt中复制的 质粒复制区序列ori1030和用于选择的红霉素抗性基因。
1. 启动子的选择
解决方法： 1）使用革兰氏阳性细菌或真核生物细胞，它们都缺少外膜， 能直接分泌蛋白进入培养基。 2）通过遗传工程将革兰氏阴性细菌改造成蛋白质分泌型。
3. 外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达
• 包涵体是致密的不溶性复合物，含有大部分的表达蛋白， 可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化。 • 一些以可溶性蛋白形式表达时易被降解的蛋白质，以包涵 体形式表达时却可以很稳定。通过超声波破碎、离心等能 较容易地对之进行初级纯化。用盐酸胍或尿素变性溶解包 涵体中的蛋白质，透析除去变性剂后，蛋白质可重新折叠 复性。 • 缺陷：经变性/复性后正确折叠的蛋白质的产量不稳定， 有时会很低，更有些蛋白尤其是分子量较大的蛋白基本上 不能正确进行重折叠
第十六章 细菌基因工程
第一节 细菌基因工程的发展现 状和发展趋势
细菌与基因工程关系密切
• 细菌是单细胞、结构简单的原核微生物， 目前对其生理代谢途径以及基因表达的调 控机制研究较为透彻 • 细菌的物种和代谢类型多种多样，对环境 因子敏感，易于获得各类突变株 • 生长速度快，便于大规模培养，容易进行 遗传操作
1）表达载体(expression vector) 用来控制转录、翻译、蛋白质稳定性以及克隆基 因产物的分泌等遗传元件。 2）宿主细胞： 大肠杆菌、枯草芽胞杆菌 酵母及动物、植物、昆虫细胞、动植物个体等
一 表达载体构建原则
• 表达元件的选择和利用 • 克隆载体：满足在宿主菌中复制和选择要求的载体。 • 质粒载体，整合载体。
• 未来市场前景广阔的药品： 单克隆抗体、反义药物、基因治疗药物、 可溶性蛋白质类药物和疫苗
细菌是生产蛋白药物的最好生物反应器
①对化学方法难以合成的中间体进行合成，从而生 产活力更强的衍生物，例如更高效的抗肿瘤药物 羟基喜树碱和前列腺素
②使微生物产生新的合成途径，从而获得新的代谢 产物，例如去甲基四环素等 ③利用微生物产生的酶，对药物进行化学修饰，例 如多种半合成青霉素的生产 ④生产天然稀有的医用活性多肽或蛋白质，如用于 抗病毒、抗肿瘤的药物干扰素和白细胞介素等
• “超级工程菌”是第一个获得美国专利的 生物工程菌株
3、细菌工程菌与食品、饲料及其他工业
• 食品生产：利用生物技术构建的品质优良 的食用乳酸杆菌能提高生产菌在食品发酵 过程中的稳定性，改善发酵食品的质量并 且降低了成本，大大缩短生产周期。
• 相关产品：酶制剂、氨基酸、维生素、增 稠剂、有机酸、乳化剂、表面活性剂、食 用色素、食用香精及调味料等
3、微生物细胞表面表达系统
• 微生物细胞表面展示系统的构成：载体蛋白、目的蛋白和 宿主菌株。 • 位于细胞表面的蛋白都可用于细胞表面展示，常见的载体 蛋白包括： 1）大肠杆菌的外膜蛋白和与肽聚糖相关的脂蛋白
2）假单胞菌的外膜蛋白F(OprF)和冰核蛋白INP
3）蜡状芽胞杆菌群的S-层表面蛋白(Surface layer protein)
4. 外源基因在细胞表面的表达 （表面展示技术cell surface display ）
• 把目的蛋白基因序列(外源蛋白)与特定的载体蛋白基因序 列(又叫定位序列)融合后导入微生物宿主细胞，从而使目 的蛋白表达并定位于微生物细胞表面。
三、常见细菌表达系统
• 大肠杆菌并不一定是所有外源蛋白表达的 理想微生物，除了大肠杆菌以外，还有许 多其他细菌的表达系统
第三节
细菌基因工程的应用
基因工程的实践主要有3种表现形式
• 改造细菌使之性状得到遗传改良，获得更好的应 用效果，如杀虫、固氮等
• 制作生物反应器，利用细菌来生产某种物质
• 为了得到某些高表达量的细胞内代谢产物而细菌 进行必要的遗传学改造，将与目标代谢产物合成 有关的基因转入到合适的细菌，相当于在宿主菌 中重新载入了或加强了某条生理代谢途径，从而 在宿主细菌中得到理想的细胞次级代谢产物，如 链霉菌中的新抗生素的合成
4、细菌工程菌与农业生产
• 各类农业微生物的应用是实现农业可持续发展和 保护生态环境的有力保证。 • 由于自然菌株和传统技术本身的一些缺陷与不足， 诸如研究周期长、成本高、活性低等，实现农业 微生物的产业化受到很大限制
• 基因工程为微生物遗传改良提供了有效手段
第二节 细菌基因工程的表达系统
• 表达系统组成：外源基因、表达载体和宿主细菌。
• 农用抗生素产生菌的遗传操作 • 杀虫抗病重组微生物 • 其它重组杀虫抗病微生物 （1）生物囊杀虫剂 （2）基因工程抗病菌 （3）杀虫抗病工程菌
生物囊杀虫剂
将Bt毒素蛋白基因转入萤光假单胞菌，使之形成伴胞晶体， 将菌体杀死但不破坏伴胞晶体而且菌体外形保持完整，其有 效期平均增加了两百多倍，无污染，成为一种新型的微生物 杀虫剂，用于蔬菜害虫防治。