内毒素及其去除

如二乙胺乙基（DEAE）阴 离子交换介质适于从碱性蛋
白质（即带正电的蛋白质， 如尿激酶）中去除内毒素，
成本低，吸附容量大， 但这种方法不适用于带 负电荷的蛋白
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疏水与分子筛
疏水层析法利用高盐增加蛋白疏水性与介质结合，而在 高盐体系中内毒素由于脂质A部分有很强的疏水性发凝 集，无法与层析介质结合，因此能够有效去除内毒素
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阴离子交换层析
离子交换层析的速度快、载量高、浓缩效应好 ,在早期下游纯化中担当重要角色。一般而言, 内毒素比蛋白质在阴离子交换介质上的结合强 很多,分子量越小的内毒素结合得越强,多数要 在柱再生(1M氯化钠) 或在位清洗(1M氢氧化钠 )时才从介质上洗脱下来
内毒素在pH〉2时都是带负电。阴离子层析填料自身带 正电能够吸附内毒。可使用流穿模式，上样前样品PH控 制在目的蛋白PI以下，使其带正电。这样内毒素结合在 填料上，目的蛋白直接流穿
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内毒素是什么
内毒素也称为脂多糖或 LPS，是革兰氏阴性菌 胞壁上一种成分（少数 阳性菌也能产生）。其 细胞壁外膜的外部脂质 成分完全由内毒素分子 组成 ，死亡时则会释 放大量内毒素。一个大 肠杆菌细胞约含有200 万个LPS分子
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分子筛是利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的 一种方法。一般抗体分子量为几万道尔顿,而内毒素分子 量为几十万至上百万道尔顿,常是多聚体,因此利用分子筛 可以有效去除内毒素,但其处理量小,处理时间较长。
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亲和层析
亲和层析
以组氨酸 、 组胺、 多粘菌素 B、聚阳离子等为配基
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亲和层析
在低pH时,内毒素分子中磷酸酯基和羧基离子化减小。在分子内疏 水作用的驱使下内毒素分子趋于更为紧凑的结构,从而减少了相互 作用的位点,导致去除率的下降。随着溶液pH的增大,内毒素分子的 紧凑结构被分子内静电相互作用破坏,舒展的结构使内毒素分子与 固载于琼脂糖上的配基产生更为有效的作用,导致去除率的升高。 在高 pH 下内毒素去除率的下降可能是因为键合于基质上的疏水配 基的构像发生扭曲变形所致。
功能部分
疏水性， 毒性部分
脂质 A
多糖 链
磷酸 基团
结构复杂， 特异性部分
带负电
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不同的革兰氏阴性细菌,其 LPS的化学组成有一定的差别 ,但都含有内脂 A 部分
极 高 的 热 稳 定 性
250℃ 30分钟
带 负 电
等电点 在2左右
亲 水 兼 疏 水
糖亲水 脂疏水
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6.层析法，选用合适的层析填料和溶液体系，能够有 效去除产品中的内毒素，是目前单抗纯化生产中的主 流工艺。 7.相分离法、适用于蛋白制品，但各有缺点。
内毒素去除方法存在选择性差，样品回收率低等问题。下面主要介 绍几种生产中常用的方法
一
相分离法Triton X-114
二
阴离子交换层析
三
疏水层析与分子筛
将内毒素底物LAL或多粘菌素 B(PMB)偶联于CNBr-Sepharose 或NHS-Sepharose上,以此介质特 异性吸附内毒素,而让蛋白通过
。
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亲和层析
亲和配基 PMB 与内毒素之间的作用主要是疏水与静电作用,而盐浓度即 离子强度的变化会反方向影响这两种作用 : 离子强度增大会增强亲和配基PMB与内毒素之间的疏水作用,同时又会减 小两者之间的静电作用 ; 离子强度减小会减小亲和配基PMB与内毒素之间的疏水作用,同时又会增 大两者之间的静电作用。疏水作用与静电作用的协同作用导致了上述结 果。
主要用于玻璃、 塑料和 其它高分子材料器皿上
内毒素的去除
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4.蒸馏法，超滤法，反渗透，此法一般在生产注射用水 时用到，蒸馏需要多级蒸馏并且加隔沫装置，反渗透成 本高。 5.吸附法，内毒素在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶 土等吸附而除去。由于对蛋白有吸附故不适合用于生物 制品。
显ห้องสมุดไป่ตู้ 基质法
0.006-15EU/ml
显色基团吸光度变化
精度高、灵敏 度高
仪器和试剂贵, 操作比较复杂
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自身特点
极少的养分G-即可存活，
内毒几乎无处不在
单体、聚集体种类繁多 性质不均一
内毒素
热稳定性高 180℃ 3 hours
相互作用
本身带负电，可以和带 正电的碱性蛋白结合
通过二价阳离子(如 Ca2+) 的桥接作用和酸
性蛋白形成复合体
类脂A的疏水特性导致 其和疏水性蛋白结合
1.高温烘烤 热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解 ，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底 破坏。此法适合玻璃器皿的去内毒
2.碱消毒（室温条件下）
四
亲和层析
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相分离法Triton X-114
此法用于较大重组蛋白质（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除 ，经过三次相分离后，LPS从104 EU/ml降到了几个EU/ml， 去除率超过97%，蛋白的回收率大于90%。
适用于亲水性蛋白的内毒去除，会使一些有毒的 Triton X-114 残存在蛋白溶液中
内毒素存在形式
单体
胶束
囊状
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医药制剂
本身不合格或放置 时间过长
输液器
未消毒彻底
注射器
操作污染
0.5—1 小时
冷颤 发热，头痛 恶心，呕吐，脸色苍白 血液循环障碍
休克
死亡 2ng/kg体重即能引起发热
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生物制品中内毒素标准
药品、生物制品的细菌内毒素限值（L，EU/mg）一般按以
部分药品由 于自身特殊 性无法通过 稀释法消除 干扰，因此 鲎试验还无 法完全取代 家兔热原试 验
凝胶法
大于0.03EU/ml范围
缓慢翻转180°，目测 终点
简单,经济, 不需专用测定设
备 特异性不强 精密度、定量性差
浊度法
0.006-300EU/mL
浊度变化
简单、快速、灵敏 度高、检测范围宽 需精密的专用仪器
下公式确定：
我国药典要求注射剂中细 菌内毒素＜1EU/ml
细菌内毒素标准在制定时应定为计算值的1/3~1/2。
K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，单位 EU/（kg · h） M 为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，单位mg/（kg · h）
常用内毒素检测方法
内毒素与 鲎试剂的 凝胶反应