碱的高速逆流色谱分离及其结构鉴定

O59’J5"7 "O I5J1<K17"5I ’#L’#"5IM O<"4 JB1 #’J1<’# <""JM "O ;/*)0’3( /%&(0/-%#40 )1PQ$ 9.4 :$+*# ： B58B3MK11I 9"C7J1<39C<<17J 9B<"4’J"8<’KB( （ E-::: ） ； I5J1<K17"5I ’#L’#"5IM ； P15NCJ571 ；41M’9"75J571 ；B(K’9"75J571 ；;/*)0’3( /%&(0/-%#40 - 附 子 为 毛 茛 科 植 物 乌 头（ ;/*)0’3( /%&< 分［ ! 0 & ］。此外， 二萜 类 生 物 碱 成 分 还 会 导 致 心 律 不 齐、 呼吸衰竭 等 毒 副 作 用［ $ 0 ) ］。 由 于 它 既 具 有 活 性 又具有毒性， 所以建 立 二 萜 类 生 物 碱 成 分 的 高 效 分 离制备方法对附子药材及其产品的开发和利用具有 重要的意义。
(0/-%#40 )1PQ$ ） 的子根， 是 常 用 中 药， 已广泛应用 于多种疾病 （ 诸 如 虚 脱、 昏 厥、 风 湿 热、 关 节 痛、 痢疾 和水肿） 的治疗
［#］
。 在 附 子 中， 二萜类生物碱是其
发 挥 抗 炎、 镇痛和神经肌肉阻断活性的主要成
梁敬钰， 教授 $ 01# ： （ "!$ ） *’!)#&"+ ，234’5# ：6(#5’78"* , #!+ $ 9"4$ ! 通讯联系人： 基金项目： 中国药科大学研究生基本科研业务费专项资金项目 （ %"$ "!&#""** ） $ 收稿日期： !"## 3"# 3"$
［ % & #’ ］
公司； 实验用水为蒸馏水。 ! $ #" 样品制备 ! ! 取生 附 子 药 材 ’* ?$ ， 粉 粹， 加 $" H 乙 醇 "* < ， （ 每 次 ’ )） ， 过 滤， 合 并 滤 液， 减压回 冷浸提取 ( 次 收乙醇， 得浸 膏。 用 浓 盐 酸 调 ’3 至 (+ * ， 用乙酸乙 合并萃取液并减压浓缩至干， 得油脂部 酯萃取 ( 次， 分。再用氨水 调 ’3 至 $+ * ， 用 乙 酸 乙 酯 萃 取 ( 次； 合并萃取液并减 压 浓 缩 至 干， 得 总 生 物 碱 %* $ 。 冷 藏保存备用。 ! $ $" 两相溶剂系统及样品溶液的制备 ! ! 根据体积比配 制 适 量 体 积 的 正 己 烷 % 乙 酸 乙 酯 % 甲醇 % 水 （ (- "- )- " ，I J I J I J I ） 混合液， 将 之置 于分液 漏斗中， 充分振荡 后 静 置 分 层， 分 取 上 下 相， 以上相 为固定相， 下相为流动相， 并在使用前进行脱气处理 (* 0#- 。 ! ! 样品用上相和下相各 " 0< 溶解。 ! $ %" 分离与鉴定 ! $ % $ !" 34!!! 分离 ! ! 将 固 定 相 以 #* 0< J 0#- 的 流 速 注 满 高 速 逆 流 色谱仪的螺旋管， 转 速 为 %"* / J 0#- ， 样品注入进样 圈 （ 常规 34!!! 二 次 分 离 过 程 需 溶 剂 系 统 平 衡 后 进样） ， 同时流动相以 ’+ * 0< J 0#- 流速 泵入。开启 根据色谱图 检测器和记录仪， 检 测 波 长 为 ’(" -0 ，
（ ! ! "#$%&’(#)’ *+ ,-.’*/-#(01’&. ，2-0)% ,-%&(%/#3’0/%4 5)06#&10’. ，7%)80)9 "!###$ ，2-0)% ； " ! 2#)’#& +*& :)1’&3(#)’%4 ;)%4.101 ，2-0)% ,-%&(%/#3’0/%4 5)06#&10’. ，7%)80)9 "!###$ ，2-0)% ）
"#$%&’($) &)* #’+,-’,+. (*.)’(/(-&’($) $/ ! !" *(’.+0.)$(* &%1&%$(*# /+$2 !"#$%&’( ")*(%"+),-% 34 5(657#0..* -$,)’.+7-,++.)’ -5+$2&’$6+&054
=+@ &57ABC" # ，DE?%F -565’ # ，G?%F :BC7BC’ ! ，H+? G1 # ，=+@ /578B’7 # ，=+?%F /578(C # !
。Hale Waihona Puke Baidu例 如： 从乌头中分离得到了
一个单酯类 二 萜 生 物 碱 （ 苯甲酰中乌头碱） 和一个
［ #( ， #) ］ 。本实 醇胺类 二 萜 生 物 碱 （ #" % ! %53 尼 奥 灵 ）
验采 用 34!!! 技 术， 选择合适的溶剂体系从附子 的总碱粗提物中分离得到了北草乌 碱 （ 6(#7,.#-( ） 、 中乌 头 碱 （ 0(&1*+-#.#-( ） 和次乌头碱 （ "2’1*+-#% .#-( ） （ 结构见图 # ） 。
刘敏卓 # ， - 张思佳 # ， - 杨春华 ! ， - 夏 - 烨# ， - 刘静涵 # ， - 梁敬钰 # !
（ # $ 中国药科大学天然药物化学教研室，江苏 南京 !#"""% ；! $ 中国药科大学分析测试中心，江苏 南京 !#"""% ） 摘要： 应用高速逆流色谱法分离制备了生附子 中 的 ’ 个 : #% 型 二 萜 生 物 碱 类 化 合 物。 以 正 己 烷 3 乙 酸 乙 酯 3 甲 醇 3 水 （ ’. $. &. $ ，; , ; , ; , ; ） 为 两 相 溶 剂 系 统， 上 相 为 固 定 相， 下 相 为 流 动 相， 在 主 机 转 速 *$" < , 457 、 流 动 相 流 速 !/ " 4= , 457 、 检测波长 !’$ 74 条件下进行分离制备； 一次性从 %" 48 附 子 总 碱 粗 提 物 中 分 离 制 备 得 到 #$/ ’ 48 北 草 乌碱， ’$/ # 48 中 乌 头 碱 和 !!/ ) 48 次 乌 头 碱， 经 高 效 液 相 色 谱 分 析， 测 得 它 们 的 纯 度 分 别 为 %)/ % > 、 %+/ ! > 和 %%/ ! > 。并应用波谱 （ 电喷雾离子质谱、 核磁共振氢 谱 和 核 磁 共 振 #’ : 谱 ） 解 析 法 确 定 了 它 们 的 结 构。 利 用 该 方 法 可以对生附子中的二萜类生物碱成分进行快速的分离和纯化。 关键词： 高速逆流色谱法； 二萜生物碱； 北草乌碱； 中乌头碱； 次乌头碱； 生附子 中图分类号： *+$*- - - 文献标识码： ? - - - 文章编号： #""" 3*)#’ （ !"## ） "$ 3"&’" 3"$
#(
!" 实验部分
! $ !" 仪器、 材料与试剂 ! ! 89:%(** ; 型 高 速 逆 流 色 谱 仪 （聚四氟乙烯管 缠绕在 ( 个水平轴上 形 成 的 螺 旋 管， 管 径 ’+ , 00 ， 柱体积 (** 0< ， 进 样 圈 体 积 ’* 0< ） 、 89=%"*#* 型 双柱塞恒流泵 （ 上海同田生化技术有限公司） ；;> (** 型 核 磁 共 振 谱 仪 （ 瑞 士 9/,?(/ 公 司 ） ；;$#@(-. ##** <!%A4 液 相 色 谱 % 质 谱 仪 （ 美国安捷伦科技有 限公司 ） ； 4=B%’* ; 紫 外 % 可 见 光 （ C>%>D4 ） 检测器 （ 日本 岛 津 公 司 ） ；;$#@(-. ##** 3=<! 高 效 液 相 色 谱仪 （ 美国安捷伦科技有限公司） ；E’*** 色谱 工作 站 （ 浙江大学智达信息工程有限公司 ） ；3F%#*"* 恒 温循环 器 （ 北京博医康实验仪器有限公司） ；G:% ’*** 型旋转蒸发仪 （ 上海亚荣生化仪器厂） 。 ! ! 生附子药材是由四川雅安三九药业有限公司提 供， 经四川农业大学傅体华教授鉴定为正品药材； 硅 胶购自青岛海洋化工厂； 正己烷、 乙酸乙酯、 甲醇、 二 氯甲 烷、 石 油 醚、 氯 仿、 乙 醇、 浓 盐 酸 等 均 为 分 析 纯， 购自南京化学试剂厂； 乙腈为色谱纯， 购自德国默克
! 第"期
刘敏卓， 等： 生附子中 !#$ 型二萜生物碱的高速逆流色谱分离及其结构鉴定
・ )(#・
! ! 在 最 近 几 年， 人们应用高速逆流色谱 （ "#$"% &’(() *+,-.(/%*,//(-. *"/+01.+$/1’"2 ，34!!! ） 技术从乌头属的其他种类中成功分离纯化得到了二 萜类生物碱成分
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图 ! " 生附子中分离出的化合物的结构式 !"#$ !" %&’(")*+ ,-./)-/.’, 01 )0(20/34, ,’2*.*-’4 1.0( !"#$%&’( ")*(%"+),-%
收集各色谱峰组分。 ! $ % $ #" 3=<! 分析及结构鉴定 ! ! 附子总生物碱和高速逆流色谱分离得到的各组 分 用 3=<! 分 析。 3=<! 条 件：;$#@(-. K+/61L （ #"* 00 . ’+ # 00 ，" ! 0 ） ； 流 :*@#’&( FB9%!% 柱 动相为 ’ $ J < 庚烷磺酸 钠 （ 含 *+ ’ H 三 乙 胺， 用磷酸 调 ’3 至 (+ * ） % 乙腈 （ ,"- (" ，I J I ） ； 等度洗脱时 间为 #" 0#- ； 流 速 为 #+ * 0< J 0#- ； 检 测 波 长 为 ’(" -0 ； 进样量为 #* ! < 。 ! ! 34!!! 各峰组 分 的 结 构 根 据 电 喷 雾 离 子 质 谱 （ :4D%A4 ） 、 核磁共振氢谱 （ # 3%EAG ） 和核磁共振
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研究论文
生附子中 !!" 型二萜生物碱的高速逆流色谱分离及其结构鉴定
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