动物微生物3.4 病毒感染的实验室诊断

项目三病毒

任务五病毒感染的实验室诊断

一、病毒的一般诊断程序

（一）标本的采集和处理

用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒，因此必须根据病毒的生物学特性、病毒感染的特征、流行病学规律以及机体的免疫保护机制，来选择所需要采集标本的种类、确定最适采集时间和标本处理的方法。标本采集必须无菌操作，如有细菌污染，可通过加抗菌素、过滤和离心等方法处理。由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经处理后一般应立即接种。若需要运送或保存，数小时内可置于50％中性甘油内4℃保存，对需较长时间冻存的标本最好置于-20℃以下或干冰保存。

以感染病毒的动物病料采集为例，一般说来，应从病畜体内存在病毒最多的器官或组织采取病料。例如上呼吸道疾病取鼻分泌物，脑炎取脑组织，痘症取患部皮肤。采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。检查抗体时，则采取一个病畜的初期和恢复期的血清，以了解抗体滴度的变化。

（二）病毒的分离培养

病毒与细菌不同，病毒是严格的活细胞内寄生的，因此分离培养病毒应采用寄主接种法、鸡胚培养法或细胞培养法，而且还必须根据不同病毒的要求进行选择，才能得到满意的结果。

1、寄主接种法

分离的标本接种于实验寄主的种类和接种途径主要取决于病毒寄主范围和组织嗜性，同时还应考虑操作、培养及结果判定的简便。

噬菌体标本可接种于生长在培养液或培养基平板中的细菌培养物。

植物病毒标本可接种于敏感植物叶片，产生坏死斑或枯斑。

动物病毒标本可接种于敏感动物的特定部位，嗜神经病毒接种于动物脑内，嗜呼吸道病毒接种于动物鼻腔。常用动物有小白鼠、大白鼠、地鼠、家兔和猴子等。在兽医病毒学实践中，还常用本动物进行实验感染试验。例如，应用健康马驹作马传染性贫血病毒接种试验；应用健康猪、鸡分别作猪瘟病毒、鸡新城疫病毒接种试验等等。接种病毒后，隔离饲养，每日观察动物发病情况，根据动物出现的症状，初步确定是否有病毒增殖。

2、鸡胚培养法

不同的病毒可选择不同日龄的鸡胚和不同的接种途径，如痘病毒接种于10～12d的鸡胚绒毛尿囊膜上，鸡新城疫病毒宜接种在10d尿囊腔和羊膜腔内，虫媒病毒宜接种于5d卵黄囊，继续培养观察。

3、细胞培养法

用机械方法或胰蛋白酶等方法将离体的活组织分散成

单个的细胞，在平皿中制成贴壁的单层细胞，然后铺上动

物病毒悬液进行培养。细胞培养是目前最常用的方法。

（三）病毒的鉴定

病毒鉴定是诊断病毒性疾病的可靠方法，也是病毒分

类的前提。一般可通过以下方法确证病毒的存在：

1、病毒的群体形态特征

（1）噬菌斑

噬菌斑测定一般采用双层平板法，将一定量经稀释的

噬菌体悬液与高浓度敏感菌悬液及半固体琼脂培养基(1％琼脂)混合均匀后，然后倒入含底层琼脂培养基(2％琼脂)的平板，经过一段时间培养后，在细菌菌苔上会出现一个个圆形局部透明区域，即噬菌斑。可以认为，每个噬菌斑是一个噬菌体侵染的结果，一个噬菌斑中的

图3-14 噬菌斑

噬菌体遗传性都相同，故通过多次重复接种，可获得纯系噬菌体。因每种噬菌体的噬菌斑有一定的大小、形状、边缘和透明度，故可作为鉴定的指标。此外，噬菌斑亦可用于病毒的定量。

（2）空斑和感染病灶

一些动物病毒在动物细胞或组织培养系统培养时，由于病毒感染细胞裂解，出现与噬菌斑类似的空斑或称蚀斑。如果是肿瘤病毒，细胞不是被溶解，而是生长速率增加，导致受感染细胞堆积起来形成类似于菌落的感染病灶。

（3）枯斑

一些植物病毒会在茎、叶等植物组织上形成一个个褪绿或坏死的斑块称枯斑或坏死斑。

2、血凝现象及干扰现象

血凝现象是指许多病毒能吸附于一定种类哺乳动物或禽类的红细胞表面而产生凝集的现象。如流感病毒、天花病毒等。可根据病毒凝集的血细胞种类及凝集条件不同而鉴定病毒。

两种不同的病毒同时或先后感染同一宿主细胞时，一种病毒抑制另外一种病毒增殖的现象，称为病毒的干扰现象。如乙型脑炎病毒能干扰脊髓灰质炎病毒，流感病毒能干扰西方型马脑炎病毒的增殖等。若在某一组织细胞培养物中同时加入接种物及可被干扰的病毒，若后者被抑制，则可间接判断接种物中存在可干扰后者的病毒。

3、细胞病变效应

是指病毒在细胞内增殖及其对细胞产生损害的明显表现，例如细胞发生凝缩、团聚、肿大，细胞融合形成多核现象，细胞脱落、裂解，细胞内出现包涵体等。用于细胞培养的标本一般以细胞病变效应作为病毒感染的指标。

细胞病变是特定的病毒与细胞相互作用的结果，不同病毒感染同一细胞时可能呈现不同的细胞病变效应，同一病毒在不同的细胞上也可引起不同的效应。此外，培养液成分、温度、病毒感染时细胞年龄等也会对细胞病变效应(CPE)产生影响。

1．细胞融合现象

细胞融合现象是指由于病毒感染宿主细胞而出现的多核细胞现象。其发生决定于病毒和细胞的种类，也受病毒数量、温度、离子强度等因素的影响。如仙台病毒可在Hela细胞、猪肾继代细胞内引起细胞融合，但不能在人的二倍体成纤维细胞中诱发融合现象。

2.包涵体

某些细胞在感染病毒后，出现于细胞质或细胞核内的，在光镜下可见的，大小、形态和数量不等的小体称为包涵体。

包涵体可以是病毒粒子的聚集体，如昆虫核型多角体病毒、质型多角体病毒的包涵体和腺病毒的包涵体；也可以是病毒结构蛋白与感染有关的蛋白质等病毒组分的聚集体，如人类巨细胞病毒的致密体等。

由于不同病毒包涵体的大小、形状、组分以及存在于宿主细胞中的部位均不同，所以包涵体可用于病毒的快速鉴别和某些病毒疾病的辅助诊断指标。例如，烟草花叶病毒与马铃薯Y病毒的形态极其相似，但它们的包涵体形态截然不同，前者为三角形，后者为矩形；狂犬病病毒在病犬大脑海马角、小脑、延及的神经细胞的细胞质内形成嗜酸性圆形或卵圆形的内基氏小体(Negri)，可用Seller氏染色法染色镜检。

4、其他鉴定方法

利用电镜技术及热、紫外线、脂溶剂等理化因子对病毒感染性的作用，病毒组分的分子量、沉降系数、核酸类型等的测定，也可用于病毒的鉴定。建立在抗原抗体特异性反应基础上的免疫学方法也是病毒鉴定的一类常见方法。此外，通过分子杂交、序列测定、PCR等分子生物学方法鉴定病毒也有重要意义。