微生物细胞破碎优秀课件

设备
破碎率的动力学方程 破碎作用遵循一级动力学定律：
dR Rm能使放出的蛋白质最大数量(mg/g)
k(R R) m
R为t时间内释放的蛋白质数量(mg/g)
dt k破碎的比速度
1
l
nRm [/R (mR)]l
n kt 1x
xR/
Rm
ln 1/[1 (R ) ]K V/qv
影响反应常数K的因数：
微生物细胞破碎
几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物
药物名 胰岛素 人生长激素
干扰素
宿主 大肠杆菌 大肠杆菌
大肠杆菌
用途
治疗糖尿病
治疗侏儒症
治疗毛状细胞白 血病和卡波济肉
瘤
§3、1细胞壁的组成与结构
细胞壁
特殊组分：
外 膜
脂多糖
脂质双层 脂蛋白
形态与结构
一、细菌
肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁 酸、半乳糖胺 氨基酸：D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-谷氨 酸、L-赖氨酸 磷壁质 糖 脂质
Doulach理论：
R 1ex [p p ({ p 0)/Z ]}
Z：常数 P：破碎压力 P0：临界压力 ：细胞浓度参数
3、超声波破碎法（液相剪切的一种方法）
原理：超声波引起空穴，在相当高的输入声能
下，液体各部分会形成许多小气泡，在声波膨 胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡 会被压缩，直到不能在压缩时，气泡破破裂， 释放出猛烈的阵。这种震波通过介质传播。在 气泡发生空穴现象的破碎期间，大量身能转化 成弹性形式的机械能，引起局部的剪切梯度使 细胞破碎。
转盘外缘速度 细胞浓度 珠粒大小 温度 流量
提高破碎率的方法：
延长研磨时间
增加珠体装量
提高搅拌速度
提高操作温度
2、液体剪切法（高压匀浆法）
• 原理：利用高压使细胞破碎。
不宜采用高压匀浆的破碎的微生物 细胞： ❖已造成堵塞的团状或丝状真菌； ❖较小的革兰氏阳性菌； ❖含有包含体的基因工程菌
高達20,000PSI(約138MPA)以上的壓 縮氣體，可以有效的將細胞膜打破。
特殊结构
荚膜
Capsule
肺炎链球菌
化学组成： 多糖或多肽
功能：
抗吞噬作用 粘附作用 抗有害物质损伤作用
产汽荚膜杆菌 肺炎链球菌
二、真菌和酵母
糖及其氨 基衍生物
氨基酸 脂质
三、藻类
四、细胞结构与细胞破碎
细胞对破碎的敏感度
细胞 动物细胞 G-芽孢杆菌和球菌 G+芽孢杆菌
酵母 G+球菌
孢子 菌丝
产物占菌体总蛋白/%
50% 20% 25%
〉30%
6%~26%
外源蛋白的积累
形成包含体 在细胞区间 形成包含体 形成包含体 形成包含体 形成区间包含体 形成包含体
破碎的动力学方程：
ln Rm kNp Rm R
R：蛋白质释放量； Rm：蛋白质最大的释放量； p：操作压力； k：速率常数； ：与微生物种类有关的常数
平板计数法 1、直接计数法
2、间接计数法
血球细胞计数器 产物测定法
电导法
二、细胞破碎方法的分类
超声波：超声波
液体剪切 机械搅拌：振动器
细胞破碎
机械
固体剪切
压力：Chaikoff 挤压机 研磨：研棒、研钵、珠磨
压力：X-压滤机
干燥 非机械
真空干燥 空气干燥 冷冻干燥 溶剂干燥
物理：渗透冲击
溶胞 化学：阴、阳离子洗涤剂
有效
有效
红色
细胞壁对酒精的通透性
主要为 外膜
有内毒素
细胞壁的化学组成不同
内毒素为阴性菌细胞壁成分
脂多糖
青霉素作用部位为肽聚糖
无效
五肽交联桥
无效
溶菌酶作用部位为肽聚糖
聚糖骨架
细胞膜
位于细胞壁内紧包细胞质，结构与真核细胞基本相同。
功 生物合成 能 物质转运
分泌呼吸
细胞膜电镜照片
载体蛋白
脂质双层
细胞膜 模式结构图
包含体形成的可能性：
包含体:蛋白相互交联 在一起形成不溶性的聚集物
可溶蛋白的集聚超过溶解度； 蛋白合成太快，导致分子间疏水相互作用聚合而不溶； 高表达的蛋白没有形成正常的二硫键连接； 蛋白的助溶物缺乏； 包含体的形成与蛋白的稳定性有关。
外源蛋白在大肠杆菌中的积累
蛋白
人胰岛素 -丙酰胺酶 -人体干扰素 凝乳酶原 牛生长激素 -内酰胺酶 人胰岛素原
蛋白释放的动力学方程：
1RPexpKp(t)
蛋白释放常数k取决于输入的声能。
Kp[W ( W 0)/]
破碎效果: 杆菌>球菌; 革兰氏阴性>革兰氏阳性; 细菌>酵母.
超声波破碎过程中的影响参数：
振幅； 细胞悬浮液的粘度； 表面张力； 被处理悬浮液的体积； 探头的形状和材料； 细胞悬浮液的流速；
酶：溶菌酶、酶噬菌体溶胞
1、固体剪切方法（珠磨）
原理：进入珠磨机的 细胞悬浮液与极细的 玻璃小珠、石英砂、 氧化铝等研磨剂（直 径小于1mm）一齐搅 拌或研磨，研磨剂、 珠子与细胞之间的相 互剪切、碰撞，使细 胞破碎，释放出内含 物。在珠液分离器的 协助下，珠子被留在 破碎室内，浆液流出 从而实现连续操作。
机械放破碎的缺点：
需要高的能量并且生产高温和高的剪切力，易 使不稳定产品变性失活； 破碎非专一性； 碎片尺寸分布广泛。
4、酶溶法
原理：利用酶分解细胞壁上特殊的化学键使之 破壁的一种方法。
优点：产品的选择性高； 抽提的速率和收率高； 产品破坏最少； 对pH和温度等外界条件要求底； 不留细胞残片。
声波 7 6 5 3.5 3.5 2 1
搅拌 7 5
（4） 3 (2) (1) 6
液压 7 6 5 4 3 2 (1)
冷冻压力 7 6 4 2.5 25 1 5
§3、2细胞壁的破碎
一、破碎率的评价 破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量
的百分比数，即：
Y (% [N 0 )N )/N 0] 1% 00
G+ 菌肽聚糖结构:
五肽交联桥 五个甘氨酸 四肽侧链 L-丙、D-谷、L-赖、D-丙 聚糖骨架 G：N-乙酰葡萄胺 M：N-乙酰胞壁酸
G- 菌肽聚糖结构:
聚糖骨架： 同G+ 菌
四肽侧链： L-丙、D-谷 DAP、D-丙
细胞壁
G+ 菌与G- 菌细胞壁的比较
细胞壁 强度 厚度 肽聚糖层数
革兰阳性菌 较坚韧
20-80nm 可多达560层
革兰阳性菌 较疏松
10-15nm 1-2层
肽聚糖含量
磷壁酸 外膜
占细胞壁干重 占细胞壁干重5%-
50%-80% 20%
有
无
Hale Waihona Puke Baidu
无
有
细胞壁
G+ 菌与G- 菌的差别及与细胞壁的关系
项目 革兰阳性菌 革兰阴性菌
细胞壁的关系
染色性
抗原性
毒性
对青霉 素的作 用 对溶菌 酶的作 用
紫色 主要为 磷壁酸 无内毒素