人免疫缺陷病毒抗体测定

人免疫缺陷病毒抗体测定

1．样品的接收、登记和处理

1.1 采血3-4ml，收集到促凝管中（可采用常规用量的肝素或枸橼酸钠抗凝）

1.2检查样品的状况，有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，要将样品情况立即通知送样人。

1.3仔细核对样本与送检单,然后编号

1.4样品为全血（抗凝），用3.000r/min离心15min，血清/血浆备用。打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。

1.5 每天上午进行样品的检测。节假日（短期1周内）进行检测的样品存放于2～8℃，需长期存放的样品，应置于-20℃以下。需保存的血清在采集、保存过程中应注意无菌操作。

2.检测方法和步骤

2.1检测方法（一）

酶联免疫吸附试验（ELISA）

2.1.1 基本原理

以珠海丽珠试剂股份有限公司的ELISA（双抗原夹心法）为例。

采用双抗原夹心ELISA方法检测血清或血浆中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体。在微孔条中预包被高纯度HIV（1+2）抗原，通过检品中抗HIV抗体桥连作用，与后面加入的HRP 标记抗原结合，HRP对底物TMB作用显色。通过酶标仪检测吸光度（OD值）从而判定检品中是否存在抗HIV抗体。

2.1.2检测步骤

实验准备：试验开始前将试剂和样品放置在室温(18～23℃)，平衡30分钟后使用。

配液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用

备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。

准备实验原始记录表

2.1.3 实验操作

2.1.

3.1装好所需使用数目的孔条,每孔均加入50μl样品稀释液。留一孔作空白对照,暂不加任何液体。另设3个阴性对照孔，1个HIV-1阳性对照孔，若需要可再设1个HIV-2阳性对照孔。

2.1.

3.2每孔加入50μl待检样品及对照（对照要后加），加样时吹打混匀则效果更佳。在反应板上加盖封板膜,振荡混匀,置37±2℃温箱或水浴锅中，孵育40min。

2.1.

3.3置洗板机上洗涤6遍, 每次静置30～60S, 洗完后

孔上方及底部不应残存液体。

2.1.

3.4每孔加入100μl酶结合物(空白对照孔不加)，在反应板上加盖封板膜,振荡混匀,置37±2℃温箱或水浴锅中，孵育40min。

2.1.

3.5洗板6次后, 每孔依次加入底物A、B液各50μl （包括空白对照孔），加盖封板膜,振荡混匀, 37℃避光显色15 min。

2.1.

3.6 每孔加入终止液各50μl（包括空白对照孔），振荡混匀终止反应。

2.1.

3.7 用空白对照孔调零, 并尽快用酶标仪单波长450nm，或双波长450/630nm测OD值。

2.1.4实验结果

2.1.4.1 临界值(Cut- off值)计算:

Cut- off值= 0.08 + 阴性对照OD平均值(阴性对照OD平均值≤0.05按0.05计算)

2.1.4.2 结果判定:

样本A值≥临界值时为抗HIV抗体阳性

样本A值＜临界值时为抗HIV抗体阴性

2.1.5 登记和报告

2.1.5.1填写实验原始记录表；将样品信息和检测结果录入标本登记表。

2.1.5.2对呈阴性反应的样品，出具HIV抗体筛查报告或化

验单；对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。

2.1.5.3 复检试验：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性如均呈阳性反应，或一阴一阳，送艾滋病确认实验室进行确认。

2.2检测方法（二）

金标法

2.2.1基本原理

将特异性的抗原（或抗体）以条带状固定于硝酸纤维膜上，将胶体金标记试剂吸附在结合垫上。当待测样品（血清或尿液）加到试剂条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解固化的结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原（或抗体）的区域时，待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。

以英科新创的人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒为例

用经胶体金标记的重组HIV抗原（Au-HIV-Ag）包被的玻璃纤维素膜、重组HIV抗原（HIV-Ag）和抗HIV单克隆抗体包被的硝酸纤维素膜制成。检测阳性样本时，血清样本中HIV 抗体与胶体金标记抗原结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的重组HIV-Ag

结合形成“Au-HIV（1+2）-Ag- HIV-Ab- HIV(1+2)-Ag”夹心物而凝聚显色，游离的胶体金标记重组Au-HIV（1+2）-Ag 则在对照线处与抗HIV单克隆抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色。

2.2.2检测步骤：

2.2.2.1 将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温

2.2.2.2 从包装盒中取出测试卡平衡至室温，打开铝箔包装袋，平置于台面上

2.2.2.3 用微量加样器取60μl样本血清，加到测试卡的加样处；或用试剂盒内所配塑料滴管吸取样本，垂直滴加三滴于测试卡的加样处。

2.2.2.4 加样后，阳性标本可在1-30分钟内检出。

2.2.3 结果判定

阳性：测试卡在检测区和对照区位置出现两条紫红色条带。如果检测区的紫红色条带隐约可见，建议对该样本重复试验，并使用其他方法确认。

阴性：测试卡只在对照区位置出现一条紫红色条带

失效：对照区未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏或者是样本中抗体的含量过高。在此情况下，将待测标本稀释后用新的测试卡重新测试。

注意：测试区（T）内的紫红色条带可呈现颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，即使只