第六章讲义双水相萃取

双节线：把均相区和两相区域分隔开。 系线：连接双节线上两点的直线。
两相区
均相区
在同一条系线上的各点分成的两相具有相同的组成， 但体积比不同
临界点：当系线长度趋向于零时，即在图中的C点， 两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为 1，成为单相体系。
ATPS相图
双节线(bi-nodal)：
形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子 的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而 具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。
常用的双水相体系
高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称Dextran) 高聚物/无机盐体系： 硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。
双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS)
PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖(dextran)
第一节 双水相分离理论
• 双水相萃取的原理 • 是生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物
质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用 和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的 存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不 同，即分配系数不同。
三步双水相萃取酶的流程示意图
（二）PEG循环
• 在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和 循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可 以节约化学试剂，降低成本。
• PEG的回收有三种方法： • ①加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG； • ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去
PEG，再洗出蛋白质。 • ③超滤
苷酸等风味物质 • （4）萃取细胞、细胞器、膜等粒子 • （5）应用于液－液分配层析
• 双水相的应用举例
• 分离和提纯各种蛋白质(酶）
• 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从α-
淀粉酶发酵液中分离提取α - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最 适宜条件为PEG1000 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ,pH = 8 ,α- 淀粉酶收率为90 % ,分配系数为19. 6 , 蛋白酶的分离系数高达15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收率高于60 %。
第六章双水相萃取
精品
双水相萃取？
利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的 差异来进行萃取的方法。
双水相的形成
将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合 物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相， 这就是双水相体系。这种含有不同聚合物分子的溶液发生 分相的现象叫聚合物的不相容性。
C 临界点(critical point)：当系线长度 趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在 两相中的分配系数均为1。如K点。
(1)成相聚合物的影响
A、成相聚合物分子量
对于PEG/Dextran所形成的双水相 体系中，若降低PEG相对分子质量， 则生物分子分配于富含PEG的上相中， 使分配系数增大；而降低Dextran相 对分子质量，则分配系数减小。 若想在上相获得较高的蛋白质收率， 对于PEG聚合物，应降低它的平均分 子量，相反，若想在下相获得较高的 蛋白质收率，则平均分子量应增加。
（三）无机盐的循环
• 一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6℃， 使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；
• 另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收 盐类。
二、大规模双水相萃取及其简单设备
两步萃取法连续分离胞内酶的 流程示意图
第三节 双水相萃取技术在生物、食品 工业中的应用
• （1）提取酶和蛋白质。 • （2）进行萃取性生物转化 • （3）酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核
（4）温度的影响 分配系数对温度的变化不敏感
成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作 活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4 ℃) 低, 有助于相的分离并节省了能源开支。
（一）目的物的萃取
1、如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则 细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水 相萃取工艺获得较高的纯化倍数。
一步双水相萃取：是把生物材料悬浮液和双水相 系统混合后，其中下相含有大多数杂质，而上相 含目标产物。
两步双水相萃取：把一步萃取体系中的上相分离 出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系，则 富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物 的盐相通过超滤等操作得到分离目标。
2、如果细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小， 则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化 倍数。
(2) 盐的种类和浓度
盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反 映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。
①盐的种类
• 在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系 数，不同电解质的正负离子的分配系数不同，从 而产生不同的相间电位。由于各相要保持电中性， 使得带电生物大分子，如蛋白质和核酸等分别向 两相移动分配。
②盐的浓度
• 盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰 乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相 体积比。
例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸盐浓度及 Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变， 这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数， 如图。
离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点， 通过调节双水相系统的盐浓度，可有效地萃取分离不同的 蛋白质。
B、成相聚合物的浓度
• 聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的长度为 零，此时分配系数为1，即组分均匀的分配于上下 相.
• 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总 浓度增大，系统远离临界点，系线长度增加，两 相性质的差别(疏水性等)增大，蛋白质分子的分 配系数将偏离临界点处的值(m=1)，即大于1或小 于1。因此,成相物质的总浓度越高，系线越长， 蛋白质越容易分配于其中的某一相。
图中的曲线。双节线以下的区域为均相区, 以上的区域为两相区，即ATPS 。
系线(tie line)：
双节线上两点的直线。
系线反映的信息
A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同， 而体积不同的两相。两相体积近似服从杠 杆规则
B 性质差异：系线的长度是衡Hale Waihona Puke Baidu两相间 相对差别的尺度,系线越长,两相间的 性质差别越大；反之则越小.