蛋白质分离纯化与鉴定

实验原理三： DEAE-Cellulose离子交换层析
离子交换层析ion exchange chromatography
低盐洗脱液
高盐洗脱液
混合蛋白质
实验操作三：纯化
1. 平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡离子交换柱，紫外 检测仪、记录仪基线稳定; 2. 上样:取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切， 立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面; 3.洗涤:样品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗涤柱壁1次; 4. 收集γ-球蛋白:将0.02mol/LNH4Ac缓冲液充满层析柱， 与高位恒压槽连通，开启自动部分收集器进行收集； 5. 洗涤其他球蛋白:记录仪基线恢复到零后,用0.06mol/L NH4Ac流洗，不用进行收集
构造和功能
波长 电源 光量 灵敏度 调零
根据光吸收原理设计，光源为紫外光，可监测具有 紫外吸收物质(蛋白质、核酸、多肽、酶)的检测仪器， 与层析柱、部份收集器及记录仪配套，组成一个完整的 液相色谱分离分析装置。
使用方法
1. 检查：连接是否正确，将“波长”旋钮旋到所需波长刻度； 2. 预热：按下 “电源”开关，电源指示灯亮； 3. 调100%：把“灵敏度”旋钮选择到“100％”档，调节“光量” 旋钮，数字显示为100，即透光率为100％； 4. 调零：把“灵敏度” 旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调 节“调零”旋钮，数字显示为“0”。 备注：以上步骤需反复调节几次。在样品检测过程中，不可再调 节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变 “灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。
Precipitate
上清转至另一Ep管备用； 沉淀＋0.5ml dH2O，离心，留上清液备用。(白蛋 白和球蛋白分别留200ul用于电泳上样)
实验原理二：凝胶层析
凝胶过滤gel filtration
Sephadex structure (Left: molecule; Right: model)
实验操作三：纯化
6.收集白蛋白:待记录仪基线恢复到零后，用0.3mol/L NH4Ac缓冲液流洗，自动部分收集器进行收集; 7. 柱上再生:待记录仪基线恢复到零后,用1.5mol/LNaCl0.3mol/LNH4Ac流洗，不用进行收集; 8. 再次平衡:待记录仪基线恢复到零后，用0.02mol/L NH4Ac流洗1-2个柱体积
柱层析实验 仪器二：BSZ-100自动部份收集器
构造和功能
选择 复位 手/自动 置数 切换
按照设定的时间自动收集样品
使用方法
1. 准备：检查“漏液报警板”、试管插在收集架上； 2. 定位：按“复位”键，“报警”后，再按“复位”键，仪器自 动复位；把安全阀上横杆一头的硅胶管对准第一根试管位置，固 定好螺钉； 3. 定时：按 “手动/自动”键，仪器为[手动]状态，按“选择”键 选定位置，按“置数”键设置时间，再按“选择”键确定； 4. 自动收集：按“切换”键，“收集”指示灯亮，仪器为[收集]状 态；按“手动/自动”键，仪器为[自动收集]状态； 5. 停止收集：或按“手/自动”键，仪器为[手动]状态或关电源。
实验原理四：蛋白质定量
考马斯亮蓝G250染色法：
考马斯亮蓝G250 Coomassie brillient blue在一定浓 度乙醇和酸性溶液中呈现红色。此条件下，考马斯亮 蓝G250可以与蛋白质结合，颜色从红色变为蓝色，最 大吸收峰从465nm移至595nm。考马斯亮蓝G250与蛋白 质的复合物在595nm波长处具有很高的光吸收系数， 并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。利用这一性质可以 定量测定蛋白质的浓度。
浓缩胶电流：8mA，分离胶电流：18mA 待示踪染料迁移至胶底时，关掉电源，停止电泳。
5. 剥胶和染色：
将凝胶剥离，用考马斯亮蓝R250染色2h
6. 漂洗：
用甲醇：冰醋酸：水=3：1：6比例配制漂洗液，少量 多次进行漂洗直至凝胶脱色
思考题
1、紫外检测仪的数据与记录仪的图形之间有无定量关 系？为什么？ 2、采取那些方法可以调节流速？不同大小的流速对实 验结果有何影响？ 3、还有那些脱盐方法？试比较各自优缺点？ 4、分析凝胶层析的结果？ 5、分析离子交换层析中不同缓冲液的作用？ 6、SDS的作用是什么？上样缓冲液的作用是什么？ 7、样品处理的目的是什么？ 8、试叙述蛋白质分离纯化的一般原则？ 9、试叙述蛋白质分离纯化的原理？
蛋白质分离纯化与鉴定 —综合性实验
三峡大学医学院生物化学教研室
实验目的
1、从血清获得高纯度的白蛋白 2、掌握蛋白质盐析、 G-25葡聚糖凝胶层析脱盐 、DEAE-纤维素离子交换层析、 SDS-PAGE电 泳的原理与实验操作技术 3、掌握考马斯亮蓝G250染色法定量检测蛋白质 的原理和操作方法 4、了解紫外检测仪、自动部分收集器、记录仪 、恒压高位槽的原理与使用方法
—— 1.00 0.10 6.34
2.50 0.05 0.01
2. 样品处理：
40%甘油 溴酚兰 Loading buffer SDS β-巯基乙醇
0.5M Tris-HCl（pH 6.8）
50ul样品 50ul(2×)Loading buffer
Mix
950C/5min
3. 上样：
4. 电泳：
柱层析实验 仪器三：LM17型记录仪
构造和功能
量程显示 量程/零位切换键 抬/落笔手柄
电源
纸速显示 纸速启停 调纸速
当样品流过检测仪时，记录仪即可绘出洗脱图谱
使用方法
1. 打开：按“电源” ； 2. 调零：按“量程/零位” 键，零位指示灯亮，数码管显示“Po” ，按[左移]或[右移]键，使记录笔移至所需零位； 3. 选择量程：按“量程/零位” 键，量程指示灯亮，数码管显示当 前量程范围，按[增加]或[减少]键，使量程为10mV； 4. 调纸速：按“启/停”键，“纸速显示” 闪烁，按“调速”键调 节纸速，确定后按“启/停”键； 5. 记录：取下记录笔的塑料笔套，压下“抬/落笔手柄”；
实验原理五：SDS-PAGE电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis
SDS带负电荷，破坏蛋白质的氢 键、疏水键，使之形成单个亚基。 SDS-蛋白质复合物为雪茄形的 长椭圆棒，消除或掩盖了不同种 类蛋白质间原有电荷的差异。 SDS -蛋白质复合物在凝胶电泳 中的迁移率只是蛋白质分子量的 函数有关。
实验操作四：蛋白质定量
1 1mg/mL标准 白蛋白（µ l） 考马斯亮蓝 G250（ml） 2 6 54 3
3 12
48 3
4
5
6
7
Hale Waihona Puke Baidu
测定
0
24
36 3
36
24 3
48
12 3
60
0 3
30.0样品 30.0
3
蒸馏水（µ ） 60 l 3
充分混匀后以1管调零，在595nm处测定各管吸 光度。然后以蛋白质浓度为横坐标，吸光度An作纵 坐标，绘制标准曲线。在标准曲线上查出检测管吸 光度对应的蛋白质浓度。
优点：①与凯氏法及Lowry法相比操作简便，能同时 测定多个样品；②敏感度高于Lowry法；③复合物颜色 稳定；④对干扰剂无Lowry法及紫外吸收法那样敏感。 缺点：①有时会有非特异性吸附，同等量的不同种类 蛋白质测定值之间可能会有较大的偏差；②要求样品完 全溶解；③样品不能回收使用；④高浓度的Tris、EDTA 、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去垢剂等对测定 有干扰作用。
实验原理一：盐析
盐析salting out
高浓度的中性盐可以中和蛋白质表面电荷、夺取 蛋白质周围的水化膜，破坏蛋白质在水溶液中的稳定 性，从而将蛋白质从溶液中析出。
水化膜 + + + + + + +
常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等
实验操作一：盐析
0.5ml Serum 0.5ml s(NH4)2SO4 5000rpm/10min Mix Supernatant
实验原理五：SDS-PAGE电泳
上样器 阴极
样品槽
电泳 方向 上电极缓冲液
聚丙烯酰胺凝胶板 阳极
下电极缓冲液
实验操作五：SDS-PAGE电泳
1. 制胶：
试剂 分离胶（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 30%单体 3.50 10%SDS 0.10 蒸馏水 3.84 0.5M Tris-HCl （pH 6.8） —— 10%过硫酸铵AP 0.05 四甲基乙二胺TEMED 0.01 浓缩胶（ml）
Sephadex G25
1,000-5,000
Sephadex G50
1,500-30,000
Sephadex G150 Sephadex G200
4,000-150,000
5,000-400,000
5,000-800,000
实验操作二：
G-25葡聚糖凝胶层析脱盐
1. 平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡G-25柱，紫外检测 仪、记录仪基线稳定; 2. 上样:取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切， 立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面; 3.洗涤:样品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗涤柱壁1次; 4. 收集:将0.02mol/LNH4Ac缓冲液充满层析柱，与高位 恒压槽连通，同时开启自动部分收集器进行收集； 5. 再次平衡:继续用0.02mol/LNH4Ac流洗直到记录仪基 线恢复到零。
实验流程
蛋白质盐析 葡聚糖凝胶Ｇ-25（脱盐）
DEAE-Cellulose离子交换（纯化） 蛋白质浓度检测 SDS-PAGE电泳法 （鉴定蛋白质纯度）
柱层析实验装置
Buffer Reservoir Column
Recorder
UV monitor Fraction Collector
柱层析实验 仪器一：HD-3紫外检测仪
Table. Physical Characteristics of Polydextran Gels
Designation
Fractionation Range(MW) Designation Fractionation Range(MW)
Sephadex G10
700 Sephadex G100